真菌论文1

深部真菌感染早期诊断技术进展

Recent advances in early diagnostic approaches of invasive fungal infection

赵勇 王红

首都医科大学附属北京友谊医院 100050

Summary: Fungi and Bacterium have a good balance in living human body. Due to wide application of antibiotics ,immunosuppressants and hormones in clinical patients, and outspread of organic transplantation and catheter intubation, invasive fungal

infection on immunocompromised host contribute most to morbidity and mortality of those patients. Invasive fungal infection includes candidemia, aspergillosis,and cryptococcosis, which has various pathogen. This review involves traditional bacteriological methods, image technique and various laboratory tests, such as

detection of (1,3)-b-d-glucan and galactomannan, Polymerase chain reaction (PCR) on fungal DNA, and so forth. The recently licensed sandwich enzyme-linked

immunoabsorbent assay for the detection of Aspergillus galactomannan antigen has been employed in clinical practice. As documented, a sensitivity of 75%, specificity of 100%, and positive and negative predictive values of 100 and 97%, respectively, take more attention. Preventative strategies against fungal colonization and infection are critical in high-risk patients of invasive fungal infection and prompt treatment depends on the ability of serological and molecular diagnostics to detect infection earlier. Combination of above methods will benefit to earlier dignosis of invasive fungal infection. Multicenter clinical trials on efficiency of those diagnostic techniques and empiric treatment are urgently needed.

真菌在人体中,与细菌之间起着重要的微生态平衡作用。近年来,随着抗生素、免疫抑制剂及皮质类固醇激素在临床上广泛应用,器官移植、导管插管等普遍开展,深部真菌感染率越来越高。深部真菌感染免疫功能下降的患者仍是感染相关发病率和死亡率的最显著的原因。据统计,近30年深部真菌感染的发病率增加了3～5倍,真菌感染已成为艾滋病的重要死亡原因之一。引起深部真菌感染的病原菌主要有白色念珠菌、曲菌和隐球菌等。在白色念珠菌感染导致的死亡率由于广泛预防性应用氟康唑下降的同时，曲霉菌导致感染在过去十年增长3倍，而其他霉菌如镰刀霉、接合菌导致的感染的报道也日渐增加。1

深部真菌感染的定义同真菌定植不同。真菌定植是不存在任何临床感染的症状和体征时一处或多处浅表培养真菌阳性。而深部真菌感染分为确诊和疑似感染：确诊深部真菌感染需满足下列标准之一：1）血、脑脊液、腹水和活检标本存在真菌；2）眼科学证据；3）发热情况下从至少两处表浅部位分离出真菌并且b-D葡聚糖大于11pg/ml；4）在影像学提示肺炎的情况下从支气管肺泡灌洗液分离出真菌。疑似真菌感染定义为b-D葡聚糖大于11pg/ml且体温大于38℃，且抗生素治疗一周以上反应不佳，或存在肺炎或食管炎的影像学证据。2

一般认为在深部真菌感染的病人及时抗真菌治疗对改善预后相当关键。3然而由于传统的诊断技术敏感性差，深部真菌感染的准确及时诊断存在很大障碍；

尽管培养和组织学在确诊疾病方面仍然相当重要，有时由于血小板减少不能进行活检。4支气管肺泡灌洗液的阳性率也低，通常发现胸片异常再行灌洗延误诊治。5

由于诊断的不确定，在抗生素抵抗的中性粒细胞减少患者应用经验性抗真菌治疗很广泛。然而，发热并不提示特异的疾病，故经验性治疗存在缺陷，不同的患者出现深部真菌感染的危险性不同，因此大多数患者接受不必要的治疗。

因为深部真菌感染多发生于免疫低下患者，感染常不易控制，因此深部真菌感染的早期治疗很关键。但由于深部真菌感染的临床及影像学的表现不特异，以及当前实验室诊断方法的敏感性差，通常早期诊断被延误。为了降低深部真菌感染的死亡率，必须对高危病人进行早期控制性的治疗策略，这就需要发展快速的、敏感性高的诊断方法。而近年来在高分辨CT、血清学及分子生物学技术上的进展使这一要求变成可能。真菌的DNA及抗原如半乳甘露聚糖、葡聚糖的检测的敏感性分析已在临床进行前瞻性评价，使得感染病人的早期识别成为可能。然而，在不同的研究中这些化验分析的敏感性和特异性差别很大，受多因素的影响，如测试时病人选择和临床操作等等。关于半乳甘露聚糖的循环和释放以及真菌DNA的观点有待于证实。本文就近几年文献对这些方法的运用进行综述，评价其在诊疗策略中的作用。 一、影像学

普通胸片的价值是有限的，因为真菌感染的影像学表现各种各样，缺乏特异性。通常表现为从正常到典型的结节空洞病灶均有报道。Denning6报道空洞和基底向外的楔型病灶是深部曲霉感染的典型病变。结节影和肺泡实变融合形成结节也很典型。当疾病进展后结节空洞可导致新月征的出现。尽管此表现很典型，也不能依此确诊深部真菌感染。因为此表现也见于奴卡菌病、毛霉病和一些细菌感染。并且重症监护病房的床旁胸片的质量使得正确诊断很困难。

除此之外，CT的影像学表现也缺乏特异性，从正常到支气管肺炎表现各异。7

一些研究报道如果CT发现结节周围的groud-glass衰减的特异性晕环（CT晕环征）通常提示曲霉侵犯血管的早期识别；而气体新月征提示梗塞的肺组织与邻近肺实质之间的气体，提示中性粒细胞恢复的感染晚期；7,8而以上这些都高度提示丝状真菌感染。9Logan等人研究9例气道真菌曲霉感染患者在临床中不如血管曲霉感染常见，病变主要分布于支气管周围或细支气管周围，据实变区0.5到5cm距离不等，表现为小叶中心性结节。然而这些发现仍不是很特异，也可以见于结核和支气管肺炎。7,10

Heussel11在一项112例中性粒细胞减少但胸片正常的患者的研究中，发现60%的高分辨CT提示出肺炎的证据，其中9例证实为曲霉感染，较确诊提前5天，高分辨CT的阴性预测值为97%。Caillot观察到相似的诊断时间缩短及治疗提前，结合必要时外科清除术，明显改善了预后。然而，系统性高分辨CT扫描在感染早期非常有用，因此就依赖于扫描设备的及时使用。12 二、实验室检查

1、培养与镜检

真菌感染的实验室监测主要有四种方法：直接镜检、微生物培养、血清学实验和DNA探针。患者痰、喉或气管分泌物培养阳性率为10%到30%。当血培养显示菌落或放散的分生孢子链时可以得出阳性得结果。但只凭借培养，至少75%的患者会漏诊。13直接镜检发现分支的菌丝侵犯组织就可提示相应的真菌感染。尽管直接镜检的敏感性差，但由于培养的时间延误诊断和治疗，直接镜检仍可以提

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高早期诊断的可能。如果使用卡尔科弗卢尔(荧光增白剂)可使直接镜检准确率提

高到70%。14虽然病理组织切片镜检真菌可以确诊，但真菌培养也相当重要，尤其在曲霉菌和Pseudallescheria的鉴别上，组织切片并不能真正从形态学上区别，因此培养在这一点上有相当的诊断价值。15

在留取标本的方式上，Hoffer16等人回顾性总结了24例怀疑深部曲霉感染的儿科患者的28次影像学引导穿刺结果，组织学证实所有患者中10例患有深部曲霉感染。阴性结果的患者其后并未发展为曲霉病。因此在此研究中经皮活检诊断曲霉病的敏感性和特异性都是100%。

2、血清学

反向免疫电泳、免疫荧光、补体结合实验同放免一样依赖于正常的宿主免疫功能，通常在免疫低下的患者检验效率减低。因此血半乳甘露聚糖抗原的检测更适于免疫低下患者，可用于血和呼吸道标本。Dupont等人报道乳胶凝集实验的特异性很高，但敏感性不好。17Masahiro等人得出相似得结果，敏感性、特异性和阳性预测值分别为23%、98%和64%。其他检测抗原的实验（如酶联免疫吸附实验）可以提高敏感性，但假阳性率依然很高，约10到20%。18本文主要介绍的抗原有葡聚糖和半乳甘露聚糖

（1）葡聚糖

葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中,占其干燥重量的80%～90%，是除接合菌和新型隐球菌外的真菌特异性细胞壁成分。其中(1→3) beta D 葡聚糖占真菌胞壁成分50%以上,尤其在酵母样真菌中其含量可更高,其形式以(1→3) beta 糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链,分支状(1→6) beta D 葡聚糖残基作为侧链。19由于(1→3) beta D 葡聚糖仅广泛存在于真菌的细胞壁中,当真菌进入人体血液或深部组织后,经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后,(1→3) beta D 葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液(如尿,脑脊液,腹水,胸水等)中(1→3) beta D 葡聚糖含量增高。当真菌在体内含量减少时,机体免疫可迅速清除(1→3) beta D 葡聚糖。而在浅部真菌感染中,(1→3) beta D 葡聚糖未被释放出来,故其在体液中的量不增高。20世纪90年代初发现,(1→3) beta D 葡聚糖可特异性激活自鲎变形细胞溶解产物提取的G因子,从而旁路激活鲎试验,此过程称为G试验。临床上,由于深部真菌感染的严重程度常常与血浆多糖的升高水平一致,故可将G试验应用于深部真菌感染的诊断(包括念珠菌感染和曲菌感染等)。

闻平对健康大学生检测发现正常人群血清葡聚糖浓度均低于20pg/ml,因此以60pg/ ml为血清葡聚糖的界限值与真菌抗原抗体检测进行对比，结果提示血清

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葡聚糖的诊断敏感度大大高于抗原抗体检测。

Obayashi21测得平均正常血清水平为2.7pg/ml，高于20pg/ml为异常。其在200例血液肿瘤发热病人的研究中，使用葡聚糖在41例深部真菌感染病人中检出37例，特异性100%。Odabasi22按葡聚糖高于60pg/ml为阳性指标，对98例血液肿瘤患者进行每周两次的筛选。在所有证实深部真菌感染的患者中（6例念珠菌血症，1例镰刀霉感染，1例丝孢酵母菌感染）及高度疑似深部真菌感染的患者中以出现至少1例的样本阳性确定诊断，凭借葡聚糖先于临床诊断平均4天。对于确诊和高度疑似的感染，单次阳性的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为100%、82%、40%和100%。两次阳性的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为60%、93%、50%和95%。这项检查很有前途，进一步的研究有待于深入。

在对葡聚糖假阴性的分析中，有学者在疑似感染而且对抗真菌治疗有效的 8例中出现了 1例血清葡聚糖低于6 0 pg/ ml，考虑可能与个别种属的真菌细胞上

葡聚糖不易脱落有关。23葡聚糖的检测可以提高敏感性，虽然葡聚糖为真菌特异性成分，但为多数真菌共有，故在鉴别真菌种类的作用不大。24

（2）半乳甘露聚糖

半乳甘露聚糖对热稳定,是曲霉菌胞壁的重要组成成分,它的主要结构为D甘露糖,由N连接(90%)和O连接(10%)的寡糖组成,N连接的甘露糖以一个外展性

α-1,6 寡甘露糖为骨架,α-1,2 和α-1,3 连接的寡甘露糖为侧链。O甘露糖由短的、线性α-1,2 和α-1,3 连接的寡甘露糖组成。甘露糖在不同真菌中的含量和作用不是恒定不变的,常常受周围环境的营养状态和细胞形态的影响。其在真菌致病过程中参与了免疫调节、防御,且抗甘露糖抗体具有保护性作用。半乳甘露聚糖在深部感染时释放，在脑脊液、支气管分泌物、尿液、心包液和血液中都可检测到；相应体液中抗原的水平与组织受侵的程度以及临床预后相关。25，26，27

Maertens等人28对362例血液学高危治疗事件中前瞻性系列筛检循环半乳甘露聚糖，结合患者死后尸检发现该检查诊断深部曲霉病的敏感性、特异性、阳性和阴性预测值分别为87.9%、98.1%、87.5%和98.4%。Maertens等人29研究100名同种干细胞移植患者，自入院到出院每两周取血一次，两次半乳甘露聚糖测定值连续大于等于1.0为阳性结果，诊断深部真菌感染按欧洲肿瘤研究治疗组织和霉菌病研究组织（EORTC/MSG）诊断标准。结合尸检结果，18例证实深部曲霉感染中17例半乳甘露聚糖阳性，6例怀疑深部曲霉感染患者中未有1例阳性，其后证实疑似患者中确无感染患者。3例其他真菌感染患者半乳甘露聚糖阴性，73例无深部曲霉感染患者中仅有1例得出阳性结果。敏感性和特异性分别为94.4%和98.8%，阳性和阴性预测值分别为94.4%和98.8%。11名患者中6例半乳甘露聚糖升高早于发热，中位数时间为3.5天，2例与发热同时。7名无发热患者血半乳甘露聚糖升高是感染的首发征象。15名可评价患者中12名可于CT异常出现前平均6天检测到抗原；经验性抗真菌治疗前，88.8%患者检测到半乳甘露聚糖。半乳甘露聚糖在所有病例中除一例例外均作为深部曲霉感染的首发表现。作者提示此项化验可作为一项筛查实验，连续两次阳性有意义，可以进行预防性治疗。相反，反复阴性的半乳甘露聚糖结果提示曲霉感染的危险性很低（但是，不排除其他真菌感染）。但半乳甘露聚糖的ELISA法并不替代其他实验，应该作为全部诊断工作的一部分，Helen在检测半乳甘露聚糖时将ELISA法与乳胶凝集实验相比，ELISA法检测血半乳甘露聚糖水平更低，可达0.5±1ng/ml。30早期研究26，31有相同的结果。

Sulahian32也得出相同得结论，在450名干细胞移植患者和347名儿科血液肿瘤患者中使用半乳甘露聚糖大于1.5进行分析。然而，22例证实曲霉感染患者中5例未检测出，使得儿童群体假阳性率为10%，4倍于成人群体。

其他研究的结果就不很乐观。Herbrecht等人33在中性粒细胞减少发热、可疑深部肺曲霉病（IPA）及无曲霉病的血液肿瘤、实体瘤患者中评价半乳甘露聚糖ELISA法，按使用说明以大于1.5作为阳性结果。797例患者中按照EORTC/MSG诊断标准有153人患深部真菌感染，仅在3人中半乳甘露聚糖作为感染的首发标准。阳性预测值仅10%，但阴性预测值为100%。在可疑深部曲霉感染的患者中297例中有145例诊断真菌感染。2例假阳性和105例假阴性，阳性预测值为95.2%，阴性预测值为58.3%。然而，如果已经怀疑肺部感染的患者，这项检查不好指导早期治疗。在最终的分析中，证实诊断的病人敏感度为64.5%，疑似深部曲霉感染的敏感度为16.4%。假阳性率在儿童为44%，成人为0.9%。总体阳性预测值为57.7%，阴性预测值为84.9%。在进一步评价半乳甘露聚糖ELISA法的研究中，Pinel