中国药科大学真核细胞RNA的分离和鉴定

真核细胞 RNA 的分离和鉴定

中国药科大学 09419

综述：

RNA 分离纯化技术是现代分子生物学技术的基础，高质量的 RNA 是许多分子生物学成 功与否的关键。然而，真核细胞内大部分 RNA 均与蛋白质结合，以核蛋白形式存在，RNA 酶广泛存在细胞中，组织细胞中还有脂溶性及酸溶性小分子物质存在。故对于真核细胞而言， 有效破碎、有效地使核蛋白复合体变性、对内源 RNA 酶的有效抑制、有效地将 RNA 从 DNA 和蛋白混合物中分离、对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去等是 RNA 提取 过程中的关键点。TRIZOL REAGENT 是一种新型总 RNA 抽提试剂，可以直接从细胞或组 织中提取总 RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的 核酸酶。TRIZOL 在破碎和溶解细胞时能保持 RNA 的完整性，因此对纯化 DNA 及标准化 RNA 的生产十分有用。本次实验通过利用 TRIZOL 试剂提纯 RNA. 关键字：真核细胞 RNA ；蟾蜍卵细胞；TRIZOL 法；甲基绿-吡罗红染色液 实验目的：

学习和掌握用 TRIZOL 法来提取真核细胞 RNA 的原理和操作技术。 了解定性鉴定 RNA 的原理和方法。

实验原理： 根据成熟雌蟾蜍体内含大量卵细胞且可以方便获取，细胞内含核酸丰富，没

有其它组

织器官等的干扰等优点以确定蟾蜍卵细胞为实验所需的真核细胞。通过 TRIZOL 溶液中变性 剂破碎真核细胞，然后经过氯仿等有机溶剂抽提 RNA，再利用 RNA 不溶于异丙醇的性质将 自身析出，达到分离提纯的目的。

TRIzol 的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质 解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制 RNA 酶活性，因此 TRIzol 中还加入了 8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase（RNA 酶）。 0.1%的 8－羟基喹啉可以抑制 RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解 偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构 降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的主要作用是破坏 RNase 蛋白质中的二硫键。

甲基绿—吡罗红为碱性染料，它分别能与细胞内的 DNA、RNA 结合呈现不同颜色。当 甲基绿与吡罗红作为混合染料时，甲基绿与染色质中 DNA 选择性结合显示绿色或蓝色；吡 罗红与核仁、细胞质中的 RNA 选择性结合显示红色。其原因可能是两种染料的混合染液中 有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与聚合程度 高的 DNA 结合呈现绿色。而吡罗红则与聚合程度较低的 RNA 结合呈现红色（但解聚的 DNA 也能和派洛宁结合呈现红色）。即 RNA 对派洛宁亲和力大，被染成红色，而 DNA 对甲基绿 亲和力大，被染成绿色。

实验材料：

（一） 试剂

1. 甲基绿—吡罗红染料： ①染色剂 A 液的两种配制方法 第一种方法：取吡罗红甲基绿粉 1 g，加入到 100 mL 蒸馏水中溶解，然后用滤纸过

滤，将滤液放入棕色瓶中备用。

第二种方法：取甲基绿 2 g 溶于 98 mL 蒸馏水中，取吡罗红 G 5 g 溶于 95 mL 蒸馏水

中。取 6 mL 甲基绿溶液和 2 mL 吡罗红溶液加入到 16 mL 蒸馏水中，即为 A 液，放入棕色 瓶中备用。（注意：用于核酸染色的是吡罗红 G，请不要错买吡罗红 B。）

②染色剂 B 液的配制方法 B 液是一种缓冲液，由乙酸钠和乙酸混合而成。先取乙酸 钠 16.4 g，用蒸馏水溶解至 1 000 mL 备用；再取乙酸 12 mL，用蒸馏水稀释至 1 000 mL 备 用。取配好的乙酸钠溶液 30 mL 和稀释的乙酸 20 mL，加蒸馏水 50 mL，配成 pH 为 4.8 的 B 液（缓冲液）。

③染色剂的配制 染色剂是由 A 液、B 液混合配制而成的。取 A 液 20 mL 和 B 液 80 mL 混合，就是实验中所用的吡罗红甲基绿染色剂。应该注意的是该试剂应现配现用。

2. TRIZOL 试剂（Invitrogen 公司购买） 3. 75%乙醇 4.氯仿

5.异丙醇

6.Nacl (0.14m/l) （二）器材

1. 离心机（3000r.p.m） 2. 冰浴 3．研钵 4.烧杯 5.量筒 6.试管 7.玻棒 8.胶头滴管 9 9.离心管 10.天平

实验方法： 制备匀浆：

以班级为单位，称取大概 10g 蟾蜍卵细胞（2~3℃保存），于研钵（可置于冰浴锅上） 中，根据 10~30mg 组织细胞加 1ml trizol 试剂的量加入其中，快速研磨，制备匀浆。实 验二人合作为一组，每组取大概 10ml 匀浆。 RNA 的提取：

取回匀浆后，室温静置 10min，使样品充分裂解——离心(3000r.p.s) 20mins——取上 清液移至新的离心管——加 1/5TRIZOL 溶液体积氯仿——在手中反复振荡摇匀，室温 静置 10min。——离心 20mins——取上清液——在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室 温放置 10min。——充分混匀，静置 10minute——离心 20min——沉淀用 75%乙醇洗涤 两次 定性试验：

取 2 支干净试管，一管加入 1.5ML RNA 溶液（将 RNA 颗粒状的沉淀溶于 2 ML0.14/NACL 溶液中），另一管加入蒸馏水 1.5 ML ,像两管中加入 3 M 甲基绿-吡罗红染色 剂，溶液变成红色为阳性反应。

实验结果：

利用 TRIZOL 法可成功提取的 RNA，并使得甲基绿-吡罗红染色剂显红色。 实验注意事项：

TRIzol 对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。 由于本科生实验室里的为普通离心机，转速不高，故可适当延长离心时间。

离心后，注意上清液和沉淀的取舍以及对 RNA 层的小心吸取，否则将导致 RNA 样品中 有 DNA 污染。

还有见实验书 38 页

参考文献：

吴艳华，兰州大学学报（自然科学版），生物组织总 RNA 的高效提取，2008/04，,44 卷第 二期

崔山佳，罗明富，张金玲中国中医科学院 针灸研究所 形态研究室，北京 100700，解剖 科学进展 Progress of Anatomical Sciences 2010 Jan,16(1):48~50