蛋白的原核表达

蛋白的原核表达

一、重组质粒在大肠杆菌中的表达

1、将重组质粒和空载体质粒分别转化感受态大肠杆菌DE3。

转化步骤：

1.1 从-70℃冰箱取出感受态细菌悬液，冰上解冻；

1.2 加入质粒DNA溶液（不超过总体积10%）,轻轻摇匀，冰上放置30min; 1.3 42℃水浴中热击60s,迅速置于冰上冷却10min；

1.4 像管中加入1ml SOC,混匀后37℃振荡1h(使细菌恢复生长状态，并表达质粒编码的抗性基因）

1.5 弃大部分上清，轻轻吹匀剩下的，涂布于含AMPr的LB筛选平皿上，待干后倒置，37℃培养16-24h。

2、挑取转化后的单个菌落，接种5ml含氨苄、氯霉素的LB培养基，37℃振荡培养。

3、当菌液OD600为0.6时（重组菌培养至对数期），加入IPTG终浓度至0.2 、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L,37℃诱导培养3h,以确定IPTG对表达量的影响；在1.0mmol/LIPTG浓度下诱导培养2、3、4、5h，确定诱导时间对表达的影响；在1.0mmol/LIPTG浓度下，分别在30℃、25℃、20℃诱导培养3h,分析温度对可溶性蛋白的影响。 4、表达后取1ml菌液离心收集菌体，SDS-PAGE电泳。

5、电泳后转印到硝酸纤维素膜上，以2%BSA封闭2h，以标签蛋白/疟原虫单抗为一抗，HPR标记的羊抗鼠IgG 1:2000稀释为二抗，37℃各反应1h,洗涤后以DAB显色。

二、重组蛋白的纯化与复性

1、离心收集经诱导表达重组200ml，重悬于PBS(含1mg/ml溶酶菌)中，冰浴30min.

2、超声波破碎菌体，12000r/min,离心10min收集沉淀。

3、将沉淀用包涵体洗涤液（50mmol/L Tris-HCl PH8.0 ,1mmol/L EDTA,0.2%TritonX-100,2mol/L尿素），匀浆洗涤3次，12000r/min,离心10min收集沉淀。

4、用5ml包涵体变性液（50mmol/L Tris-HCl PH8.0 ，2mmol/L 2-ME,8mol/L 尿素）溶解沉淀，12000r/min,离心10min收集上清。

5、将上清缓慢稀释到复性缓冲液中（50mmol/L Tris-HCl PH8.0 ，0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽，1mmol/L还原型谷胱甘肽，0.5mol/L尿素），调整复性液中蛋白的浓度为100ug/ml,4℃复性24h.

6、离心收集上清，过Ni+ -NTA亲和层析柱，以洗脱缓冲液（含20-100mmol/L咪唑的复性缓冲液）洗脱，分布收集洗脱峰，对蛋白纯化过程进行SDS-PAGE分析。

7、纯化蛋白于4℃PBS透析过夜，核酸蛋白仪测定蛋白浓度，滤过除菌后-20℃冻存备用。