1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 （1） 研究目标： 通过本研究探讨胎肝细胞移植与ALR联合运用治疗急性肝功能衰竭的可行性及其相关机制，期望为临床治疗重症肝炎找到确实有效，又经济可行的治疗方法。同时探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。同时通过观察在急性肝损伤时血和肝组织中ALR和TNF-α、IL-1等炎症因子的变化关系来进一步阐明ALR的作用机理。 （2） 研究内容： a：D-氨基半乳糖制造大鼠急性肝功能衰竭模型； b：Ⅳ型胶原酶灌注消化胎鼠肝脏制备胎肝细胞； c：电转化带有HBV-S基因的重组真核表达质粒pCDNA3.1-S入胎肝细胞； d：ELISA法或免疫组化法检测含pCDNA3.1-S的胎肝细胞体外培养时表达HBsAg的情况； e：比较经不同冻存条件、不同冻存时间处理后，胎肝细胞复苏存活率； f：用ELISA法和免疫组化法检测造模组和正常鼠血及肝组织中的ALR，了解ALR的变化情况； g：用组氨酸亲和层析柱纯化大肠杆菌BL21（DE3）表达的大鼠ALR； h：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间动物存活率的差别； i：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间肝脏生化指标、常规病理变化； j：免疫组化法检测不同治疗组存活动物肝组织内HbsAg的表达及分布，以判断移植细胞的存活情况； k：用ELISA法和Northern blot检测不同处理组动物血中和肝组织内TNF-α、IL-1水平及它们的mRNA表达情况，探讨ALR的作用机理； l：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间肾脏生化指标、常规病理变化。 （3） 拟解决的关键问题： 重症肝炎的高死亡率一直困扰着临床医生，除肝移植外至今仍无有效治疗方法。我们拟通过本研究探明胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭的可行性，希望能为重症肝炎的治疗找到突破性方法。探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。同时可进一步阐明ALR的作用机理、在急性肝损伤时的变化规律以及明确它在肝脏的细胞来源。 －4－ 2. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 （1）研究方法、技术路线、实验方案： D-氨基半乳糖制备 胶原酶消化胎鼠肝 冻存、复苏 大鼠急性肝衰竭模型 制备胎肝细胞
纯化的大鼠ALR
电转化质粒 pCDNA3.1-S 至胎肝细胞
对照组 FLC＋CsA FLC＋ALR FLC ALR 比较各项检测指标 如果FLC＋ALR组有效， 再与冻存细胞进行治疗比较 注：图中FLC为胎肝细胞；CsA为环孢霉素A；ALR为肝再生增强因子。 （2）可行性分析：本课题的难点是消化分离胎肝细胞、胎肝细胞的冻存复苏、获取大量纯品ALR和鉴定移植的胎肝细胞存活状况。对于前两项相信通过反复摸索实验条件一定能获得满意结果。由于本课题是我们前一自然科学基金项目的延续。我们已构建了人和大鼠ALR的真、原核重组表达质粒，并成功地将其在真核和原核表达系统中进行了表达，获得了高效表达菌株，只要将表达产物用带镍离子的层析柱分离就可得到大量纯品ALR。我们研究所已构建了一系列含HBV-S基因的重组真核表达质粒，只要将这些表达质粒转入胎肝细胞再用于移植，就能区判定移植细胞的存活情况。此外我们还完成了人和大鼠ALR的多克隆和单克隆抗体的制备，为检测血和肝组织中的ALR提供了检测手段，要完成本课题研究应不成问题。 3. 本项目的创新之处 （1）首次探讨胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝功能衰竭的可行性； （2）首次观察急性肝损伤时血和肝组织内ALR的表达变化情况及它对TNF-α、IL-1等炎症产生的影响； （3）首次探讨胎肝细胞低温保存和复苏条件，以及作为移植供者细胞的可行性。 －5－
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