应用rmIL-18诱导肿瘤特异性CTL治疗肝癌的实验研究

应用rmIL-18诱导肿瘤特异性CTL治疗肝癌的实验研究①

米旭光 刘 磊 李首庆 魏海峰 许淑芬 谭 岩 方艳秋

【摘 要】[摘 要] 目的：研究rmIL-18在体外培养系统(Coculture system in vitro，CCs)诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)及在小鼠体内发挥的抗肝癌效果。方法：采用Stem SepTM免疫磁性细胞分离方法分离培养小鼠脾脏NK细胞、T细胞及DCs，建立体外培养系统；采用不同途径，不同剂量CTL免疫肝细胞癌荷瘤小鼠，研究CTL对荷瘤小鼠肿瘤生长速度和生存时间的影响。结果：rmIL-18能够在体外培养系统中诱导并促进CTL介导的肿瘤特异性杀伤效应；CTL能够明显抑制荷肝癌小鼠的肿瘤生长速度(P<0.01)及明显延长荷瘤小鼠生存时间(P<0.01)，并且这种作用随rmIL-18浓度的增加而增强(P<0.01)，且肿瘤内注射均优于腹腔内注射(P<0.01)。结论：rmIL-18可以在体外诱导肿瘤特异性CTL并在小鼠体内发挥抗肝癌作用。

【期刊名称】中国免疫学杂志 【年(卷),期】2017(033)004 【总页数】4

【关键词】[关键词] 体外培养系统；rmIL-18；细胞毒性T淋巴细胞；抗肿瘤 ·生物治疗·

肝癌是一种发病率高、恶性度高、预后较差、严重危害生命的恶性肿瘤，在我国恶性肿瘤的发病率中，男性居第三位，女性居第四位。采用手术、放疗、化疗等综合治疗措施后，肝癌仍居恶性肿瘤死亡率的第一位[1]。近年来，免疫治疗愈来愈受到人们的重视，并且已用于各种肿瘤的实验研究和临床治疗。IL-18

具有增强免疫、抗肿瘤、抗感染等重要作用，在肿瘤的生物治疗中表现出了广泛的应用前景[2,3]。本实验研究重组鼠白细胞介素18(recombinant mouse interleukin-18，rmIL-18)在体外培养系统诱导的肿瘤特异性CTL作用和在小鼠体内发挥的抗肝癌作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 H22细胞株为BALB/c小鼠肝细胞癌，由本室经小鼠腹腔传代培养。

1.1.2 实验动物 BALB/c小鼠，雌性，6～8周龄，20～25 g，购自生物制品研究所动物部。

1.1.3 试剂 ①小鼠T细胞富集混合单克隆抗体，含抗CD11b CMac-1、抗CD45R(B220)、抗髓样分化抗原(Gr-1)、抗红细胞样细胞(TER119)，0.2 ml可标记1×109细胞；②小鼠NK细胞富集混合单克隆抗体，含抗红细胞样细胞(TER119)、抗CD22、抗F4/80、抗CD5ccy-1、抗髓样分化抗原(Gr-1)，0.2 ml可标记1×109细胞；③小鼠树突状细胞富集混合单克隆抗体，含抗CD2、抗CD3、抗CD45R(B220)、抗髓样分化抗原(Gr-1)、抗中性粒细胞抗原(7/4)、抗红细胞样抗原(TER119)，0.2 ml可标记1×109细胞。均购于StemCell Technologies，美国。重组细胞因子 rmIL-18 本实验室制备。抗小鼠IFN-γ单抗购于长春博特生物技术有限公司。 1.2 方法

1.2.1 小鼠脾脏纯化NK、DCs和T细胞的制备 采用Stem SepTM免疫磁性细胞分离方法分离培养小鼠脾脏NK细胞、T细胞及DCs。

1.2.1.1 小鼠脾脏单核细胞悬液的制备 无菌条件下取出小鼠脾脏，以200目细胞网分离小鼠脾细胞，制备单核细胞悬液，溶解红细胞，以无血清IMDM培养基洗涤3次，调整细胞浓度至1×108个/ml，以10% FCS IMDM培养液培养备用。

1.2.1.2 分离小鼠脾脏DCs 取含1×109小鼠脾细胞悬液9 ml(含1 mmol/L EDTA无钙镁PBS)，加入Stem SepTM小鼠DCs富集混合抗体1 ml。充分混合后，37℃ 5%CO2培养30 min，PBS洗涤3次，再加入四抗体磁珠混合物，37℃ 5%CO2培养30 min，过无菌磁性筛柱，收集未标记的目的细胞，PBS洗涤3次。细胞加入含10 ng/ml GM-CSF、10% FCS的IMDM培养液，培养备用。

1.2.1.3 分离小鼠脾脏NK细胞 取含1×109小鼠脾细胞悬液9 ml(含1 mmol/L EDTA无钙镁PBS)，加入Stem SepTM小鼠NK细胞富集混合抗体1 ml。充分混合后，洗涤与磁性分离如1.2.1.2。收集的细胞加入10üS的IMDM培养液，培养备用。

1.2.2 建立体外培养系统 实验前，将分离纯化的小鼠脾脏NK细胞、T细胞及DCs按一定的细胞比例加入培养系统，其中NK细胞为16.5%、T细胞为82.7%、DCs为0.8%。

1.2.3 CTL杀伤实验 为观察rmIL-18在CCs中诱导肿瘤特异性CTL的能力，将丝裂霉素(MMC 100 μg/ml)处理1 h的H22细胞按2%的比例加入CCs，再加入不同浓度的rmIL-18(0、10、50、100 ng/ml)，37℃ 5%CO2培养96 h后收集细胞，以不同的效靶比(1∶6.25、1∶12.5、1∶25、1∶50)分别检测对125I-UdR标记的H22细胞的特异性杀伤能力。