第一讲基因工程
[循着图示·想一想]
知识点一 基因工程的基本操作工具
知识点二 基因工程的基本操作程序
知识点三 蛋白质工程
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[结合题目·试一试]
判断下列叙述的正误
(1)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(2014·江苏卷T23-A)(×)
(2)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(2014·江苏卷T23-C)(×) (3)抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达(2014·江苏卷T23-D)(√)
(4)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列(2013·江苏卷T6-A)(×) (5)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列(2013·江苏卷T6-B)(√) (6)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶(2013·江苏卷T6-C)(×) (7)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制(2013·安徽卷T6-B)(×)
(8)每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点(2011·浙江卷T6-B)(√) (9)蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质(√)(2011·江苏卷T14-A)
(10)将ada(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada(2011·浙江卷T6-C)(×)
(11)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(×) (12)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(×) (13)目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法(√)
(14)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(×) (15)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术(×) (16)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质(√)
(17)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构(×) (18)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用(×)
考点一︱基因工程的操作工具
[必备知能]
1．限制性核酸内切酶
(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如GCGCCCAGGA
CGCG以中心线为轴，两侧碱基互补对称；GGTCC以T为轴，
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错误!
两侧碱基互补对称。
(2)切割后产生末端的种类——黏性末端和平末端。
①黏性末端：是限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的(错位切)，如下图所示：
②平末端：是限制酶在识别序列的中轴线切开时形成的(平切)，如下图所示：
2．限制酶与DNA连接酶的关系
[易误提醒]
关于工具酶的五个注意点
(1)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。
(2)为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。
(3)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(4)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (5)DNA连接酶起作用时，不需要模板。
3．载体具备的条件
条件 稳定并能复制 有一个至多个限制酶切割位点 具有特殊的标记基因
4．基因工程的理论基础
目的 目的基因稳定存在且数量可扩大 可携带多个或多种外源基因 便于重组DNA的鉴定和选择 3
[必明考向]
考向 基因工程的操作工具
1．(2012·江苏高考)下图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。请回答下列问题：
↓
↓
↓
↓
(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由_______________________连接。
(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是________末端，其产物长度为________________________________________________________________________。
(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段。
(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加________的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是____________________________________________
____________________________________。
解析：(1)一条脱氧核苷酸链中相邻的两个碱基之间是通过“—脱氧核糖—磷酸—脱氧核
4
糖—”相连的。(2)从SmaⅠ的识别序列和酶切位点可知，其切割后产生的是平末端，图1中DNA片段有两个SmaⅠ的识别序列，故切割后产生的产物长度为534＋3＝537(bp)、796－3－3＝790(bp)和658＋3＝661(bp)的三个片段。(3)图示方框内发生碱基对的替换后，形成的d基因失去了1个SmaⅠ的识别序列，故D基因、d基因用SmaⅠ完全切割所得产物中除原有D基因切割后的3种长度的DNA片段外，还增加一种d基因被切割后出现的长度为537＋790＝1 327(bp)的DNA片段。(4)目的基因的两端都有BamHⅠ的识别序列，质粒的启动子后抗生素A抗性基因上也有BamHⅠ的识别序列，故应选用的限制酶是BamHⅠ，此时将抗生素B抗性基因作为标记基因，故筛选时培养基中要添加抗生素B。经过同种限制酶切割后会产生相同的未端，部分目的基因与质粒会反向连接而导致基因无法正常表达。
答案：(1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖 (2)平 537 bp、790 bp、661 bp (3)4
(4)BamH Ⅰ 抗生素B 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接
考点二︱基因工程的操作过程
[必备知能]
1．目的基因的获取
??从基因文库中获取
(1)直接分离?
?利用PCR技术扩增?
?? 基因
(2)人工合成?反转录法：以RNA为模板，在反转录酶的
?? 作用下人工合成
2．基因表达载体的构建 (1)基因表达载体的组成及作用：
化学合成法：针对已知核苷酸序列的较小
(2)构建过程：
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3．将目的基因导入受体细胞 生物种类 常用方法 受体细胞 植物细胞 农杆菌转化法 体细胞 将目的基因插入到Ti质粒的T—DNA上→农杆菌转化过程 →导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体 DNA上→表达 4.目的基因的检测与鉴定 动物细胞 显微注射技术 受精卵 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 2＋微生物细胞 感受态细胞法 原核细胞 Ca处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
[易误提醒]
关于操作过程的四个注意点
(1)限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同：获取一个目的基因需限制酶剪切2次，共产生4个黏性末端或平末端，切割质粒则只需要限制酶剪切1次，因为质粒是环状DNA分子，而目的基因在DNA分子链上。
(2)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶：如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
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3．将目的基因导入受体细胞 生物种类 常用方法 受体细胞 植物细胞 农杆菌转化法 体细胞 将目的基因插入到Ti质粒的T—DNA上→农杆菌转化过程 →导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体 DNA上→表达 4.目的基因的检测与鉴定 动物细胞 显微注射技术 受精卵 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 2＋微生物细胞 感受态细胞法 原核细胞 Ca处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
[易误提醒]
关于操作过程的四个注意点
(1)限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同：获取一个目的基因需限制酶剪切2次，共产生4个黏性末端或平末端，切割质粒则只需要限制酶剪切1次，因为质粒是环状DNA分子，而目的基因在DNA分子链上。
(2)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶：如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
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