实验方法

7 研究内容与方法

7.1 实验材料

实验材料由四川农业大学生态研究所姜福星副教授提供，种植于四川农业大学风景园林实验室，常规种植管理。

7.2 白花虎眼万年青STM和BTB基因的克隆

7.2.1 实验材料

白花虎眼万年青经过诱导后形成愈伤，然后重新诱导出鳞茎。取出无菌鳞茎，放入液氮中速冻，于 –70 ℃ 保存备用。 7.2.2 实验试剂和耗材

提取RNA所需的Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇、RNA-free水；提取DAN所需的SDS、EDTA、Tris、HCl、NaOH、CH3COONH4；克隆所需的大肠杆菌DH5α感受态细胞、pMD18-T克隆载体、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶等；培养基所需的酵母粉、蛋白胨、琼脂粉等；反转录试剂盒、胶回收试剂盒等。 7.2.3 实验中的主要仪器

本实验所涉及的仪器主要有：超净工作台、霉菌培养箱、高压灭菌锅、超低温冰箱、高速冷冻离心机、紫外凝胶成像系统、PCR仪、电泳仪、制冰机、冷冰台式离心机、核酸蛋白分析仪、水浴锅、通风橱等。 7.2.4 实验方法

（1）RNA的提取及检测

总RNA 提取采用Trizol法，具体步骤如下：

1）、研钵用酒精烧 10分钟，然后用液氮预冷，将0.2g左右的组织材料在液氮中研磨3-5次至粉末状后加入1.0mLTrizol试剂并上下颠倒摇匀，室温静止5min后置于4℃离心机中12000r/min离心5min。

2）、吸取上层清液，加入预冷的200μL氯仿，上下颠倒混匀约5min后室温静置15min，之后在4℃离心机中12000r/min离心15min。

3）、吸取上清溶液转移至新的1mL离心管中，加入500μL异丙醇，轻轻摇匀后室温静置10min。4℃离心机中12000r/min离心10min。

4）、弃上清，加500μL75%乙醇润洗沉淀，4℃离心机中12000r/min离心3min。 5）、吸出乙醇，将离心管置于无菌通风橱中风干沉淀5-10min，加

20μLRNA-free水，充分溶解沉淀，瞬时离心以收集提取的RNA溶液。

6）、取1μL制备的RNA溶液上样于0.5%的琼脂糖凝胶点样孔中，在150伏特高电压条件下电泳5-10min，观赏RNA完整性。

7）、用紫外分光光度计测得总RNA的OD260/OD280的比值，检测总RNA的纯度，OD260/OD280值介于1.8-2.0之间表明所提的RNA质量较高，低于1.8则说明样品不纯，有盐类、酚类等杂质污染，高于2.0则表明有DNA的污染。

8）、全部测量完成后，按如下公式计算RNA的浓度：OD260×40×稀释倍数，单位为ng/μl。 （2）反转录

反转录cDNA制备采用Toyobo公司的FirststrandcDNASynihesisKit试剂盒，具体操作参考产品使用说明书，实验整个过程尽可能在冰上操作，步骤如下：

1）、使用前混匀和离心各种成分； 2）、在离心管中混合下列各成分： Primer: Oligo(dT)20 lμL 10mmol/L dNTP mixlμL total RNA 2-3μg RNase-Free ddH2OμL

3）、混匀后，65℃温浴5min，完成迅速转移至冰上放置2min 4）、向第一步变性的RNA混合溶液中依次加入下列各成分： RT Buffer(5X)4μL 10mmol/L dNTP mix2μL RNase1μL ReverTra Ace 1μL

5）、PCR热循环仪程序设置为：42℃x20min，85℃x5min,4℃x5min。程序完成后，瞬时离心收集溶液，直接进行PCR操作或-20℃保存备用。 （3）DNA的提取及检测

DNA的提取采用改良的SDS法，具体步骤如下：

1)、预热SDS提取液至65℃，研钵用液氮预冷，将0.2g左右的组织材料在液氮中研磨3-5次至粉末状，加入800μL预热后的提取液，摇匀后水浴30-45min，水浴过程中每隔10min颠倒一次。

2）、取出后放入4℃冰箱冷却15min后，加400μL预冷的冰醋酸铵，混匀后

放置冰箱15min，10℃，1000r/min离心15min。

3）、吸取上清液800-1000μL至新的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后静置30min，8000r/min离心5min。

4）、弃上清，加800μL70%酒精润洗两遍，晾干酒精后加200μLTE溶液，混匀。

5）、加1μLRNAase于DNA溶液，37℃水浴1h后取1μL用于琼脂琼脂糖凝胶电泳检测。

（4）大肠杆菌的感受态的制备

采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞，其步骤如下：

1）、挑取DH5α菌液于LB的培养基上进行划线培养，37℃条件下培养过夜，使菌落长到合适大小。

2）、挑取一个过夜培养单菌落，接种在2mL含有SOB培养液的试管中，37℃条件下在恒温摇床上培养过夜。

3）、取1mL过夜培养的菌液接种到含有l00mLSOB培养液的500mL锥形瓶中，37℃条件下在恒温摇床上振荡培养，直至菌液在600nm波长处的吸光值OD600-0.35，之后迅速将菌液冰浴15min。

4）、将菌液转移至50mL离心管中，4℃条件下，4000rpm，离心l0min，弃上清，彻底提干菌液。

5）、加入16mL预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吹动打，使细胞重新悬浮，并在冰放置20min。在4℃条件下，4000rpm，离心l0min，尽量去除上清。

6）、加入4mL预冷0.1MCaC12溶液，用移液枪轻轻上下吹打，使细胞重新悬浮,加入甘油至终浓度20%。

7）、取灭菌的离心管，每管分装100μL感受态细胞，之后迅速用液氮冻存，置于-70℃冰箱保存备用。 （5）大肠杆菌的转化

采用热激法转化感受态细胞，其体步骤如下：

1）、将感受态细胞从-70℃冰箱中取出，置于冰上解冻。

2）、解冻后取80-100μL于连接产物中，轻轻混匀，于冰上静置30min。 3）、将上述混合液于42℃条件下热激90s，然后迅速置于冰上放置3min。

4）、加入800μL液体LB培养基，37℃条件下温各摇动培养1h。

5）、在含有氨苄青霉素的选择性培养基上均匀涂布已培养1h的转化后的细胞，于37℃恒温培养箱中过夜培养。 （6）STM和BTB基因的克隆

STM和BTB转录因子的克隆，在已获得的STM和BTB序列的基础上，设计引物来进行目的基因的PCR扩增。

1）、分别在cDNA水平和基因组DNA水平进行PCR扩增，取5μL的PCR产物用于1%琼脂糖凝胶电泳检测，如果条带大小和预期结果一致，则说明得到目的片段。

2）、特异性条带（目的片段）利用DNA胶回收试剂盒回收。 3）、目的基因的连接，大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备及转化。 4）、菌液PCR筛选阳性克隆及测序。

5）、目的基因的序列及基因结构分析。核苷酸序列分析由DNAMAN软件完成，氨基酸多序列比对及进化树构建由MEGA4.1软件包完成。

7.3 STM和BTB基因在白花虎眼万年青不同生长时期叶片珠芽的表达差异分析

7.3.1 植物材料处理

白花虎眼万年青经过诱导后形成愈伤，然后重新诱导出鳞茎。取出无菌鳞茎，放入液氮中速冻，于 –70 ℃ 保存备用。 7.3.2 实验试剂和耗材

实验试剂和耗材与5.2.2大致相同。 7.3.3 实验中的主要仪器

实验中的主要仪器与5.2.2大致相同。 7.3.4 实验方法

（1）、处理植株材料取样：分几次取白花虎眼万年青植株叶片以液氮速冻，-70℃保存备用。

（2）、RNA提取及反转录同上。

（3）、以cDNA为模板对所取样本进行半定量PCR反应，以Beta-actin为内参基因，反应体系相同。基因表达水平用相对于Beta-actin基因表达量的百分