法医生物物证检验 (4)

(四)鲁米诺试验； (五)孔雀绿试验； (六)氨基比林试验； (七)愈创木酯试验； (八)紫外线浓硫酸试验； (九)纸色谱法。 四、最常用的方法 (一)联苯胺试验

1．原理：过氧化氢被分解出的新生态氧使加入的无色的联苯胺氧化为联苯胺兰； 2．检验方法；

3．优点：灵敏、简便、快速； 4．缺点：该试剂有致癌作用； 5．注意事项：

(1)凡具有过氧化物酶活性的物质均呈阳性反应，一些生物源性物质如鼻涕、排泄物等亦呈阳性反应。 (2)若是血则试验应立即出翠蓝色反应。 (二)酚酞试验

1．原理：过氧化氢被分解出的新生态氧使加入的还原酚酞氧化成酚酞，在碱性溶液中呈桃红色或红色。 2．检验方法

3．优点：无毒、安全。

4．缺点：不如联苯胺灵敏，试剂配制较繁琐。 (三)鲁米诺试验

1．原理：过氧化氢被分解出的新生态氧使加入的鲁米诺试剂产生化学反应显荧光。 2．方法

3．优点：具有较高灵敏度，适用于夜间或黑暗处较大范围内寻找血痕，唾液、尿等生物体液均呈阴性反应。 4．缺点：对一些金属及油脂亦呈阳性反应。试剂本身也有发光现象。试剂易失效，现用现配。 第三节 确证试验 一、目的

确证试验是要在预试验阳性的检材中证明可疑血痕是血痕。

血痕确证试验检查的物质是血红蛋白及其衍生物，确证试验阳性，说明该检材中含有血红蛋白或其衍生物，可判定为血痕。 二、常用的确证方法

血色素原结晶试验，氯化血红素结晶试验，显微分光镜检查及显微镜下查找血红细胞等。常用的方法： (一)血色原结晶试验(高山结晶试验) 1．原理 2．方法

3．注意事项：

(1)检材加高山试剂后，若不出现桃红色结晶，可将载玻片放酒精灯上加微热，或延长反应时间，促进生成。

(2)污染严重或含量少的血痕，不易出现结晶，加热结晶亦不典型，或只出现樱桃红色；此时要用显微分光镜方法检查血色原特有的吸收线，有吸收线则可确定血痕。

(3)高山试剂久置失效，每次试验时要有血痕对照。 (二)氯化血红素结晶试验(古烟结晶试验) 1．原理 2．方法

3．注意事项：

(1)有真菌或细菌生长，水洗或过于陈旧的血痕常阴性反应。 (2)检验加热时要温热，太高将破坏血红素，而不能形成结晶。 (三)显微分光镜检查 1．原理 2．方法 3．优点：

(1)可用血色原结晶试验载片直接观察，简便、快速、灵敏、可靠。

(2)检查时若发现有氰化正铁血红蛋白、碳氧血红蛋白等物质的吸收光谱，提示出血者有氰化物、一氧化碳中毒。 第四节 种属鉴定 一、目的

血痕种属鉴定的目的是确定血痕是否是人血，不是人血还要确定是哪种动物血。 二、意义

确定了人血，才说明案件有人伤害，并需要进一步检查血型进行个人识别、动物血中含有某些于人遗传标记类似的物质，若不进行种属鉴定会将案件侦破引入歧途。所以必须作种属鉴定，结果必须准确。 三、常用的方法 (一)环沉反应

1．沉淀反应：可溶性抗原与对应的抗体在电介质存在的条件下发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，并出现沉淀线的现象。 2．影响沉淀形成的因素抗原、抗体的比例是否合适，决定是否出现沉淀反应。 (1)抗原过剩，在沉淀反应中的阻滞称为后带； (2)抗体过剩，在沉淀反应中的阻滞称为前带；

(3)抗体效价在实际工作中，后带比前带更明显、更常见。因此作沉淀反应时通常稀释抗原，并以抗原的稀释度作抗体的效价； (4)沉淀反应的最适温度为37℃，在中性条件下反应最好。 3．沉淀反应的常用方法： (1)环状沉淀反应； (2)琼脂双向扩散试验； (3)琼脂单向扩散试验； (4)对流免疫电泳。 4．注意事项：

(1)血痕量太少，浸出液稀释倍数太高，血痕过于陈旧干涸，浸泡时间太短等情况下，浸液中的血红蛋白浓度低，使沉淀反应呈阴性； (2)浸液中无机盐离子过高，酸碱度不适可使抗血清中的蛋白变性凝固，呈假阳性反应； (3)动物血痕浸液浓度过高，也于抗人血红蛋血清和抗人蛋白血清发生交叉反应； (4)血痕浸液作沉淀反应前要离心去杂质，陈旧干涸血痕浸泡时间要长或56℃孵育浸泡或弱碱溶液(如1％碳酸钾、硼酸钠、氢氧化铵)浸泡；

(5)抗血清的要求，抗血清质量的好坏，直接关系到种属鉴定的结果是否可靠。所以要求抗血清效价高，特异性好。不能与某种动物蛋白和类属动物蛋白发生交叉反应。血清透明清澈不能有絮状及沉淀物。 (二)血红蛋白等电聚焦电泳

1．原理：人与不同种属动物血红蛋白等电点不同，血红蛋白聚焦的位置和带数不同。将待测血痕与已知人及各种动物血痕同时作等

电聚焦电泳进行比较，可判定是否人血痕及何种动物血痕。

2．方法：薄层聚丙烯酰胺凝胶，T＝5％，C＝3％，5％的pH3.5～10的二性电解质。 (三)EIiSA(酶联免疫吸附试验)法

原理：人血中的IgG与酶标的抗人IgG结合成抗原抗体复合物，再加酶底物便出现颜色反应。有人血呈阳性反应，反之呈阴性反应。 (四)免疫层析胶体金试剂盒的应用，是目前最常用的方法。方便、简单、快速、准确。 第五节 血痕的个人识别 一、目的和意义

确证人血痕后，应测定血痕中的遗传标记进行个人识别，个人识别的价值是排除而不是肯定。增加遗传标记的数量，可提高个人识别率，但不能断言某一血痕是某一个体的。 二、选择遗似标记的原则：

具有良好的多态性，较稳定，检测方法已标准化、简便快速、结果稳定、重现性好。 (一)ABO血型测定

ABH凝集原测定：有三种方法 1．吸收试验(吸收一抑制试验)

(1)原理：血痕有A．B．H抗原，能与相应的抗-A、抗-B、抗-H抗体发生特异性的抗原抗体反应，使血清抗体减少或消失，而不再与相应的指示细胞反应，或反应强度减弱。否则不能抑制抗血清中的相应抗体，抗体与指示细胞的凝集反应强度不改变。根据抗血清与血痕反应前后效价改变的情况，推测血痕所含A．B．H物质，判断血痕的ABO血型。 (2)方法

(3)要求及注意事项：

①用的抗血清应是特异性好，效价高的天然抗-A、抗-B血清和抗H植物凝集素

②该方法是经典方法，结果稳定可靠，但要求检材量较多，检材量太少时易出现假阴性结果； ③吸收抗血清效价用1：16～1：32，当检材量少和陈旧时，血清效价应1：8～1：16； ④检材用抗血清浸泡时应等分，血清是以浸湿检材后吸出2d为度，过多会出现假阴性； ⑤测定吸收前后抗血清效价必须用相同且浓度适宜新鲜红细胞盐水悬液； ⑥血痕基质对抗血清有非特异性吸收作用，试验时必须作基质空白检材对照。 2．解离试验(吸收--解离，吸收放散、吸收解脱试验)。

(1)原理：血痕的A．B．H抗原在一定条件下能与相应的抗-A、抗-B、抗-H发生特异性抗原抗体反应形成复合物，56℃加热，抗体从复合物中解离出来并与相应的指示细胞结合而发生凝集反应，根据凝集反应结果判断血痕的ABO血型。 (2)方法

(3)要求和注意事项：

①方法灵敏、适合于微量检材； ②血清效价要高于1：128；

③注意洗涤的次数和每次洗的轻重程度； ④指示细胞要新鲜、浓度不宜过高；

⑤洗涤除去游离抗体时，各检材条件一致并洗涤适度； ⑥指示细胞应新鲜，且浓度不要过高。 3．红细胞粘连试验(混合凝集试验)

(1)原理：抗-A、抗-B抗体大多数为IgM，每一抗体分子具有多个抗原结合部位，当血痕与足够量抗体反应后，抗体结合到血痕的抗原上，但抗体的抗原结合部位未被全部占据，这些空着的部位能与指示细胞反应，形成血痕抗原-抗体-指示红细胞抗原的复合物。指示细胞粘附上的为阳性，否则为阴性，借此判断ABO血型。 (2)方法

(二)MN血型测定 (三)血清型测定 (四)红细胞酶型

血痕的酶活性随时间延长而下降。所选择血痕的酶型检验时要选用识别率高且稳定性好的酶类。 常用的酶型有PCM1，注意检材浸泡时用还原剂二硫代苏糖醇(DTT)使酶活性还原。 (五)DNA多态性分析 (六)性别鉴定

1．检验的方法有X、Y染色体检测。

2．DNA分析Y染色体或X染色体特异性DNA片段。 第十二章 精斑检验

学习目的和要求：现场发现精斑的意义，掌握精斑检验的程序及精斑血型检验的方法。 精液及精斑是仅次于血液常见的法医物证。精斑是精液干燥后形成的斑痕。 第一节 概 述

一、检验程序：为预试验，确证试验、种属试验确定人精斑后进行个人识别，为案件审判提供科学依据。 二、精液的组成及理化性质

(一)精液的组成：精子和精浆组成

1．固体成分：精子及各种细胞，色素颗粒，脂肪球等。

2．液体成分：精浆，由很多蛋白、酶、血型抗原无机盐等，其中精浆特异蛋白(P30)和黄递酶为精浆特有。 (二)理化性质

三、精子的形态检查

1．正常精子分头、体、尾三部分，长50～60um，外形似蝌蚪。头部正面观呈卵圆形，侧面观呈扁平形，主要由精子细胞核和顶体组成。

2．异常精子在头部、体部、尾部均有异常，正常精液中，正常精子应占85％ 第二节 精斑预试验 一、肉眼观察

其目的是发现可疑斑，确定部位和分布情况，以便准确取材。 二、预试验

目的是筛选可疑精斑，预试验阳性说明可能是精斑，但不能确定，预试验的方法很多： (一)紫外线检查； (二)酸性磷酸酶检验； (三)碘化碘钾结晶试验； (四)苦味酸结晶试验； (五)锌检出法。

实验检案中常用前二种方法 第三节 精斑的种属鉴定 一、精子形态检验

二、抗人精液血清沉淀反应

(一)原理 (二)方法

1．琼脂单扩散 2．琼脂双扩散

三、胶乳凝集抑制试验 (一)原理 (二)方法

四、精浆前列腺特异性抗原P30的检测

人类精浆中含有前列腺特异性抗原或r-精浆蛋白，是人类前列腺上皮细胞所分泌，存在于成年男性精液中的类糖蛋白，分子量为30000，故名P30。

P30有高度的种属特异性和器官特异性，P30性质稳定，是法医确证精斑的理想标记。 用抗—P30血清检验精斑中的P30抗原有4种常用的方法： (一)环状沉淀；

(二)琼脂双扩散试验； (三)对流免疫电泳；

(四)酶联免疫吸附试验(EliSA)。 1．直接斑点EliSA。

2．斑点ELiSA双抗体夹心法。 第四节 精斑的个人识别 一、ABO血型检测 (一)中和试验；

适合于分泌型精斑检验 (二)混合凝集试验； (三)解离试验；

(四)酶联免疫吸附试验(EliSA)。 1．直接斑点EliSA法。 2．间接斑点EIiSA法。

后两种方法亦可检验非分泌精斑。 二、酶型检验

(一)磷酸葡萄糖变位酶(PGM )； (二)α-L-岩藻糖苷酶(Fu)； (三)黄递酶(DIA3型)；

(四)r-谷胺酰转肽酶(GGT)。 实验检案中常用PMG 遗传标记。 三、DNA分析

第十三章 精液与阴道分泌液 混合斑的检验

学习目的和要求：混合斑检验的意义，混合斑检验程混合斑中精斑的个人识别。 一、混合斑的确证

精阴混合斑的确证可通过精液成分和分泌液成分分别确证。 (一)精液确证 同前述精液检验 (二)阴道液确证

1．阴道脱落上皮细胞的检查。 2．阴道肽酶测定。 二、混合斑的个人识别

主要分二大类方法，一类为比对推断，二是精液中特有成分的测定，实际检案中常用的： (一) 混合斑中精液ABO血型的测定

1．中合试验：适合于分泌型检材检验。当受害人是AB型分泌型时该方法无意义，当受害人为O型时有意义。 2．热解离试验：亦适合于非分型精斑检验，当受害人为O型时，检验有意义，当受害人为AB型时无意义。 3．混合斑的分离检验。

(1)原理：利用抗人精蛋白特异血清(ASPP)先将混合斑中的精斑以抗原抗体复合物的形式分离出来，再用相应的酶标单抗检验复合物中的抗原确定其血型。 (2)方法：

①蛋清粘附热解离法

②斑点EliSA法(双抗体夹心法) 4．EliSA法(双抗体夹心法)。

用特异好、效价高的抗人精血清为第一抗体，包被在聚丙乙烯聚脂板上，用酶标抗-A、抗-B、抗-H作第二抗体，检验混合斑中精斑ABO血型。

上述第1、2种方法检验时需同时检验受害人的血或唾液，以对比分析。 (二)混合斑中精子的ABO血型测定

因对精子表面抗原的来源有不同的见解，故对一些检测方法不叙述。 (三)酶型检验

办案中常检验的酶型为PGM ，方法同前述，需有受害人的血，同时检验作对照，以比对分析。当受害人为PGM 2-1型时检验无意义。 (四)精子DNA分析

对混合斑进行DNA分析，因提取DNA时已将女性物质除掉，得到的DNA图谱是纯精斑的，故可认定罪犯。是混合斑检验极其有用的手段。

第十四章 唾液(斑)检验

学习目的和要求：斑痕的发现、确证、进行个体识别的检验方法。 一、概述

唾液斑是唾液干后形成的斑迹，是法医物证中常见到的。在强奸和强奸杀人案检验精斑时，经常要采有关人和当事人的唾液进行对比检验。要掌握提取唾液(斑)注意事项。 二、唾液斑的确证 (一)淀粉酶检出

淀粉一碘反应是检查唾液斑中的液粉酶常用的方法。

1．原理：淀粉遇碘呈蓝色。唾液中含有大量淀粉酶，能将淀粉分解为糖，糖与淀粉不呈蓝色反应。因此将已知淀粉液与斑痕作用后，再加碘，若不显蓝色，说明反应系统中的淀粉已被唾液斑中的淀粉酶水解，说明有唾液存在。反之呈蓝色说明没有唾液斑。 2．方法

(二)口腔粘膜脱落上皮细胞的检查

有上皮细胞，结合淀粉酶的阳性结果判定斑痕为唾液斑。

三、唾液斑的个人识别 目前办案中常用的方法

(一)红细胞血型测定——ABO血型

1．中和试验只能检出分泌型的唾液斑血型； 2．蛋精粘片热解离法； 3．斑点EliSA法。 (二)DNA多态性分析 同血痕、精斑 (三)性别鉴定 同血痕、精斑

第十五章 人体组织的个人识别

学习目的和要求：掌握个人识别的方法。 第一节 软组织的个人识别 目前办案常用的方法：

一、蛋清粘片热解离法检验ABO血型 二、酶型检验

常用的为PGM1，和EsD酶型检验 三、DNA分析

以上三种方法检验前均将组织匀浆后，按血痕的方法检验。 第二节 指(趾)甲的个人识别 目前办案常用的

一、蛋清粘片热解离法

(一)方法同血痕检验，只是检验前需对检材作脱脂压碎的处理。 (二)特点

1．指(趾)甲ABH型物质较稳定，可长期保存。

2．经水浸、土埋的指(趾)甲的凝集原比新鲜的弱，上述情况一年以上检验ABO血型重复性不好。 3．指(趾)甲中的ABH物质耐高温，200℃处理15分钟后仍能正确检验其型物质。 二、指(趾)甲中mtDNA序列分析 方法同前述。

第三节 人类毛发遗传标记测定

毛发具有特殊的形态结构，区别于兽毛后进行个体识别的检验。 目前办案常用的检验方法：

一、取毛发经热解离试验检验ABO血型

毛发ABH型物质稳定，长期保存而不破坏。 二、取毛根作酶型检验

常用的酶型为PGM1、EsD、GLOI

酶不稳定，受环境影响易失活，所以采用拔取或离体时间不长的毛根检验。 三、取毛根作核DNA多态性分析 能达到个人识别的目的。

四、取毛干作mtDNA序列多态性分析 五、性别鉴定

以上几种方法操作均同血痕。

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