实验指导手册学生版修订四

制药工艺学实验

学习指导书

黄毅 编（第四版）

西南科技大学

生命科学与工程学院 二○○九年十二月

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制药工艺学实验 学习指导书

实验一 离子交换层析分离混合氨基酸

一.目的要求

1.学习采用离子交换树脂分离混合氨基酸的基本原理。 2.掌握离子交换层析法的基本操作技术。

二.实验原理

离子交换层析法主要是根据物质解离性质的差异而选用不同的离子交换剂进行分离的方法。各种氨基酸分子的结构不同，在同一pH时与离子交换树脂的亲和力有差异，因此可依据亲和力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来，达到分离的效果。

本实验用磺酸型强阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸pI=2.77)以及碱性氨基酸(赖氨酸 pI=9.74)的混合液。在特定的 pH 条件下，它们与树脂的结合和解离程度不同，通过改变洗脱液的pH值或盐离子浓度可分别洗脱分离。

三.实验器材和试剂

1.苯乙烯磺酸钠型阳离子交换树脂(001×7，732型) 2.2mol/L HCI 3.2mol/L Na0H

4.平衡液：0.1mol/L pH 5 的柠檬酸缓冲液（配方：附录1） 5.洗脱液：3mol/L 硫酸铵水溶液 6.标准氨基酸溶液：用上述柠檬酸缓冲液溶解天冬氨酸和赖氨酸，各配制成2mg/mL，然后按照1∶2.5的比例混合，共配置50ml 7.氨基酸显色液（茚三酮溶液）：2g 茚三酮溶于100mL乙醇中并加入3.0mL醋酸 8.砂芯层析柱（Ф2.6×20cm）、试管（Ф1×12cm）及试管架（40、30孔）、铁架台（带夹）、胶头长滴管、牛角药匙、橡皮筋（捆试管）、定性滤纸、250ml抽滤瓶（带砂芯漏斗）、称量纸、pH试纸（1-14） 9.分析天平、恒温水浴锅、真空泵

四.实验方法

1.树脂的处理：100ml烧杯中置约10g树脂，加25ml 2mol/L HCl搅拌2h，倾弃酸液，用蒸馏水充分洗涤树脂至中性。加25ml 2mol/L NaOH 至上述树脂中搅拌2h，倾弃碱液，用蒸馏水洗涤至中性。将树脂保存于100ml平衡液中备用。【已完成】

2.装柱：取洁净干燥Ф2.6×20cm砂芯层析柱1支，用夹垂直固定于铁架台上（注意垂直），关闭下端出口，自顶部沿管壁缓慢加入平衡液，待液面高于砂芯3cm处停止。然后自顶部缓慢沿壁用玻棒引流注入经处理的树脂悬浮液（提前搅拌使树脂悬浮），待树脂沉降后，打开下端出口旋钮逐步放出过量的溶液（注意控制流速，保证液面高度不低于树脂层），再补加入一些树脂，直至树脂沉积至8cm高度即可。保持柱床表面水平（不水平，可以用玻棒适当搅拌调整），并在柱床表面添加一圆形滤纸，完全覆盖树脂层。最后于柱顶部继续加入平衡液洗涤，并用pH试纸测定，当流出液pH为5时，液面高出树脂表面1cm左右时，关闭柱子出口。

3.加样、平衡：打开层析柱下端出口使缓冲液缓慢流出，待液面下弯月面几乎平齐树脂表面滤纸层时关闭出口(不可使树脂表面干燥)。用胶头长滴管将10滴氨基酸混合液仔细轻轻地沿壁环形滴加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内（1滴/3s）。当液面下弯月面刚平树脂表面时，轻轻用长胶头滴管吸取平衡液冲洗柱壁一次，然后打开下端出口，让液面缓慢下降至滤纸处（1滴/3s），关闭出口。这时以同样方式在柱顶缓慢注入平衡液3ml，并打开下端出口，开始平衡，出口溶液开始用试管收集，保持流速20滴／min，每管20滴，逐管收存，在收集过程中注意补充柱床顶部缓冲液（加入

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时要沿壁加入，勿扰乱柱床顶部也勿使树脂表面干燥。）

在收集洗脱液的过程中，每5管需检验氨基酸的洗脱情况，方法如下：于各管洗脱液中加20滴（约1ml）氨基酸显色液，沸水浴中加热15min，如溶液显紫蓝色，表示已有氨基酸穿透下来。显色的深度可代表浓度，可在A570测定。

4.洗脱：在检测到第一个氨基酸穿透后，再收集两管茚三酮反应阴性部分，关闭层析柱出口，将树脂顶部的剩余平衡液移去。这时树脂顶部加入3ml洗脱液，打开出口使其缓慢流入柱内，按上面操作方式继续用洗脱液洗脱并逐管收集(注意保持流速10滴／min)，每管20滴。同样每5管做洗脱液氨基酸检验，在第二个氨基酸完全洗脱下来以后，再继续收集两管茚三酮反应阴性的部分。

5.树脂再生：实验结束后从柱中将树脂取出，置于2mol/L NaOH洗涤30min，然后至于蒸馏水中，洗至中性，最后放于20%乙醇中避光保存。

最后以洗脱液各管的颜色深浅(以－、±、+、++……表示)为纵坐标，洗脱液管号为横坐标作图，即可画出一条洗脱曲线。

四.注意事项

1.装柱时必须防止气泡、分层及液面在树脂表面以下等现象发生。 2.使用砂芯层析柱时，轻拿轻放，并注意保护好其它玻璃器皿。

五.思考题

1.为什么混合氨基酸从磺酸阳离子交换树脂上逐个洗脱下来? 2.离子交换树脂如何保存？

3.如果混合氨基酸中包含中性氨基酸丙氨酸，实验应如何设计？

附录1：柠檬酸缓冲液

pH 0.1M柠檬酸/ml 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8

18.6 17.2 16.0 14.9 14.0 13.1 12.3 11.4 10.3 9.2

0.1M柠檬酸钠/ml

1.4 2.8 4.0 5.1 6.0 6.9 7.7 8.6 9.7 10.8

pH 0.1M柠檬酸/ml 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6

8.2 7.3 6.4 5.5 4.7 3.8 2.8 2.0 104

0.1M柠檬酸钠/ml

11.8 12.7 13.6 14.5 15.3 16.2 17.2 18.0 18.6

C6H8O7·H2O分子量＝210.14 Na3C6H5O7·2H2O分子量＝294.12 0.1M溶液含21.01g/L 0.1M溶液含29.41g/L

附录2：732型树脂特点

型号：001 * 7 粒度：16-50目 含水量(%)：46-52

总交换容量(meq/g)：4.5 最高操作温度：120℃ 允许pH范围：0-14

本产品是在苯乙烯-二乙烯苯共聚基体上带有磺酸基 (-SO3H) 的离子交换树脂，它具有交换容量大，交换速度快，机械强度好等特点．相当于美国Amberrlite IR-120、Dowex-50、西德 Lewatit-100、日本DiaonSK-1

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附录3：茚三酮反应

茚三酮反应：所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。

附录4：氨基酸离子交换层析分离的其他参考方法 参考一：

试剂和器材

一、试剂与材料

苯乙烯磺酸钠型树脂（强酸1×8，100--200目）；2mol/L盐酸溶液；2mol/L氢氧化钠溶液。 标准氨基酸溶液：天冬氨酸、赖氨酸和组氨酸均配制成2mg/mL的0.1mol/L的盐酸溶液。 混合氨基酸溶液：将3种标准氨基酸溶液按1∶2.5∶10的比例混合。 柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液（pH5.8，钠离子浓度0.45mol/L）：取柠檬酸（C6O7H8·H2O）14.25g，氢氧化钠9.30g和浓盐酸5.25mL溶于少量水后，定容至500mL，冰箱保存。

显色剂：2g水合茚三酮溶于75mL乙二醇单甲醚中，加水至100mL。 二、器材

20cm×1cm层析管; 恒压洗脱瓶; 部分收集器; 分光光度计。 三、操作方法

1、树脂的处理

将干的强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡1小时，倾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氢氧化钠处理，做法同上。最后用欲使用的缓冲液浸泡。

2、装柱

取直径1cm,长度10~12cm的层析柱。将柱垂直至于铁架上。自顶部注入上述经处理的树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一些树脂，至树脂沉降至8 ~ 10cm的高度即可。

3、氨基酸的洗脱

用pH5.8的柠檬酸缓冲液冲洗平衡交换柱。调节流速为0.5mL/min，流出液达到床体积的4倍时即可上样。由柱上端仔细加入氨基酸的混合液0.25-0.5mL，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，即刻加入0.5mL柠檬酸缓冲液冲洗加样品处。待缓冲液弯月面靠近树脂顶端时，再加入0.5mL缓冲液。如此重复两次，然后用滴管小心注入柠檬酸缓冲液（切勿搅动床面），并将柱与洗脱瓶和部分收集器相连。开始用试管收集洗脱液，每管收集1mL，共收集60—80管。

四、氨基酸的鉴定

向各管收集液中加1mL水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中准确加热15min后冷却至室温，再加入1.5mL的50%乙醇溶液。放置10分钟。以收集液第2管为空白，测定A570波长的光吸收值，以光吸收值为纵坐标，以洗脱液体积为横坐标绘制洗脱曲线。以已知3种氨基酸的纯溶液样品，按上述方法和条件分别操作，将得到的洗脱液曲线与混合氨基酸的洗脱曲线对照，可确定3个峰的大致位置及各峰为何种氨基酸。

参考二：《生物化学》第三版 上册152-153

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附录5：20种氨基酸的性质

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