肌肉特殊染色

肌肉冰冻切片常用组织学及酶组织化学染色技术

（—）苏木精和伊红染色（Hematoxylin and Eosin, HE） 1． 苏木精溶液染色10分钟 2．流水冲洗10分钟 2． 伊红溶液染色3分钟 4．流水冲洗1分钟

5．梯度酒精脱水，透明树胶封固

骨骼肌HE染色（肌膜核蓝色，肌纤维粉红色，结缔组织淡红色）

（二）改良Gomori三色染色方法（Modified Gomori Trichrome, MGT） 1． Harris苏木精10分钟 2． 水冲洗 10分钟

3． Gomori氏溶液30分钟 ～60分钟 4．0．2%醋酸浸洗1分钟

5．酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固。

骨骼肌MGT染色（核紫红,肌纤维暗绿色,胶原亮绿色 ,线粒体红色）

（三）PAS反应法(Periodic Acid Schiffs reaction, PAS) 1． 固定于Carnoiy氏固定液10分钟 2．流水冲洗2分钟 3．0．5%过碘酸5分钟 4．蒸溜水洗1～2分钟 5．Schiff氏溶液15～30分钟 6．流水洗5～10分钟 7．Harris苏木精溶液2分钟 8．流水洗5分钟

9．脱水、透明、封固（合成树胶）

骨骼肌PAS染色结果：糖原红色，肌内肌原纤维用清晰可见ⅡA纤维染色反应强，ⅡB、ⅡC、Ⅰ型纤维呈中间型。

（四）苏丹黑B染色

1.苏丹黑溶液20分钟（加盖防气化） 2． 流水洗

1． 过滤的苏木精染1分钟 4． 流水洗2分钟 5． 甘油明胶封固 结果：脂类物质染成黑色，。

（五）四氮唑还原酶(NADH—tetrarolium redutase, NADH—TR ) 1. 孵育于下列基质内30分钟，37℃

0.05M（或0.2M）Tric缓冲液（PH7.4） 30ml 硝基四氮唑（BNT）30mg NADH 24mg 2. 蒸馏水洗。 3. 甘油明胶封固。

骨骼肌NADH－TR染色(Ⅰ型肌纤维紫兰色，Ⅱ型肌纤维淡灰色)。

（六）琥铂酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase，SDH） 染色步骤

1．孵育于下列基质30分钟,37℃ （琥泊酸钠100 mg 硝基四氮唑兰 10 mg 吩嗪二甲脂硫酸盐0.3 mg 0.1M Tris缓冲液30ml 调PH7.2 ） 2．顺序在60%、90%、60%丙酮顺序脱水及蒸馏水清洗 3．甘油明胶封固。

骨骼肌SDH染色（Ⅰ型纤维色深，ⅡA、ⅡC中间型，ⅡB染色浅）

（七） 细胞色素氧化酶染色（COX） 1． 下述基质内孵育1～4小时 37℃ DAB（3， -3，-二氨基联苯二氨盐酸盐） 30mg 0．1M醋酸缓冲液 14.0ml 1%氯化锰 1.5ml 0．1%新鲜过氧化氢 0.15ml 2． 蒸馏水冲洗 3． 1%硫酸铜冲洗5分钟 4． 蒸馏水冲洗 5． 甘油封固

肌纤维呈褐红色，代表线粒体反应，细胞色素氧化酶缺陷时则无色。

（八）腺苷三磷酸酶(Adenosine Triphosphatase, ATPase) 1.制备下述溶液：

A）碱性溶液： 0.1M 巴比妥钠 1份体积 0.18M CaCl2 1份体积 蒸馏水 3份体积 调PH 9.7-11.0 B）主要孵育液及上清液：

0.1M 巴比妥钠 2份体积

0.18M CaCl2 1份体积 蒸馏水 7份体积

上述溶液分成二份即B（-）与B（+），B（-）为上清液，B（+）液为孵育液，即将B液20ml+ATP-Na:50mg调PH9.7。 C）酸性反应液：

0.2M-巴比妥醋酸缓冲液

0.2M-巴比妥醋酸盐溶液 5份体积 0.1M HCL 10份体积 蒸馏水 8份体积 调PH 4.2-4.6 2．碱性PH染色片置于A液15分钟

3．10分钟后将酸性PH染色片置C液内5分钟 4．取出

5．全部切片置于B（+）溶液内45分钟 6．制备下述溶液 1% CaCl2 2g/200ml 2%CoCl2 1g/50ml

0.01M- 巴比妥钠溶液 1000ml 7． 1% Cacl2溶液内洗三次10分钟. 8． 2% Cocl2 溶液内3分钟 9．流水洗2分钟 10．0.01M-巴比妥钠溶液内洗8次 11．1%黄色硫化铵30秒 12．流水洗15分钟 0

13．脱水、50%—100%酒精 14．二甲苯透明两次

15．封固

（九）AMP染色(单磷酸腺苷脱氢酶) adenosine monophosphate deaminase

1） 反应液

蒸馏水 14ml AMP 6mg

NBT 15mg

3MKCl 1ml(搅拌同时慢慢加入)

0.1N NaOH 调整PH6.1 DTT 8mg

2)室温1小时反应

3）150mKCl-1.5mM citrate(PH6.0) 2次洗净 4）自然干燥

5）甘油胶封片固定

（十）Acid Phosphataso染色（酸性磷酸酶）

1）反应液 ① 萘酚AS-BI（naphtol AS-BI） 1ml

巴比妥醋酸钠缓冲液(veronal acetate) 5ml 蒸馏水 14ml

②4%NaNo2(sodium nitrite) 0.8ml

副品红碱液(pararosaniline) 0.8ml 室温放置2分

②加入①中混合PH4.7-5.0用1N NaOH 调整 过滤 2） 37℃孵化60分 3） 水洗

4） 2%甲基绿(methyl green)（滤过） 数秒 酒精脱水，二甲苯透明。 5） 加拿大胶封片固定

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