花生12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B在酿酒酵母中的表达及功能分析(2)

2　　　　　　　　　　　　　　　花　生　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　35卷

　Keywords:peanut;linoleicacid;Δ12fattyaciddesaturase;yeast

Δ亚油酸(linoleicacid,LA,C18∶29,12)能降低血清胆固醇水平,预防动脉粥样硬化,并且是α-

ΔΔ亚麻酸(linelenicacid,ALA,C18∶39,12,15)、花生四烯酸(ArachidonicAcid,ARA,C20∶45,8,11,14)

等重要多不饱和脂肪酸和某些生理调节物质(如前列腺素)的前体,具有广泛的药用价值和营养价

ΔΔ12脂肪酸脱氢酶(Δ12fattyaciddesaturase,Δ12FAD)是C18∶值。29,12合成的关键酶,催化油

ΔΔ酸(Oleicacid,C18∶19)脱氢形成C18∶29,12。人类和哺乳动物由于缺少Δ12FAD而不能形成

C18∶2Δ9,12,必需从外界获取,因此C18∶2Δ9,12被称为必需脂肪酸。取,由于长期低生活水平的限制,足消费者感官品质、予特别的关注。,。

,是影响膜生理学的重要因素,动性的下降[1]植物在质体和内质网上都含有脂肪酸脱氢酶,这些脱氢酶具有位置特异性和底物特异性[2,3]。能产生多不饱和脂肪酸,特别是C18∶29,12和C18∶39,12,15。

目前很多植物的Δ12脂肪酸脱氢酶基因已经被克隆[4～7]。花生(ArachishypogaeaL.)是世界第四大油料作物,花生油中亚油酸的比例为15%～43%[8]。两个花生Δl2脂肪酸脱氢酶基因(AhFAD2A,AhFAD2B)也已经被克隆[9]。功能性鉴定内质网脂肪酸脱氢酶的首选宿主是酵母,ΔΔ因为酵母中含有这类脂肪酸脱氢酶所需要的电子传递系统,还有合适的膜环境,通过酵母表达可以进行结构/功能研究[10]。本文报道了AhFAD2B在酿酒酵母K601/p416系统中的表达,并对花生Δl2脂肪酸脱氢酶的生物学功能进行研究,为进一步研究和利用该基因,改善花生油脂质量和提高花生抗逆能力打下基础。

1　材料与方法

1.1　材　料

1.1.1　植物材料　　花生(ArachishypogaeaL.)品种为鲁花14号,由山东省花生研究所提供。

α为本实验室保存;酿酒酵母(Saccharo21.1.2　菌株与质粒　　大肠杆菌(Escherichiacoil)DH5

mycescerevisiae)营养缺陷型K601(ade2,his3,leu2,trp1,ura3),由山东农业大学郑成超惠赠;p416酵母游离型穿梭表达载体,TEF组成型启动子,CYC1终止子,CEN6/ARSH4复制起点,在酵母中筛选标记为URA3,大肠杆菌中筛选标记为Amp,由本实验室保存;T载体pUCm-T购自上海Sangon。

1.1.3　试剂和培养基　　所用DNA限制性内切酶和DNA分子量标准为TaKaRa公司产品;X-gal、IPTG、TaqDNA聚合酶、反转录酶(RevertAidTMM-MuLVReverseTranscriptase)均为上海Sangon产品;TRIzol总RNA提取试剂购自天为时代公司;鲑鱼精DNA和各种脂肪酸甲酯标

(第三准品购自Sigma公司;LB、YPD、2×YPD、CM(Ura2)培养基参照《分子克隆实验指南》

版)[11];其他常规试剂均为分析纯。

1.2　方　法

1.2.1　引物合成　　Senseprimer:5’ccggatccttaacaacacaacaatggg3’;Antisenseprimer:5’cgtttccaactcgagctatgcatcagaac3’[9],由上海Sangon合成。

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