HPLC Method development

液相色谱方法的建立

高丽萍 June 4,20111

目 录1.HPLC方法建立过程中的常见问题 方法建立过程中的常见问题 1. 2.HPLC建立的一般程序 建立的一般程序 2. 3.色谱条件的建立 3.色谱条件的建立3.1 色谱柱的选择 A.色谱柱的归类 A.色谱柱的归类 B.C18色谱柱的性能影响因素 B.C18色谱柱的性能影响因素 C.固定相种类的选择 C.固定相种类的选择 3.2 流动相的选择 A.流动相中的酸 A.流动相中的酸 B.流动相PH值与样品保留时间的关系 流动相PH B.流动相PH值与样品保留时间的关系 C.流动相中的缓冲盐 C.流动相中的缓冲盐 D.流动相中的离子对试剂 D.流动相中的离子对试剂 E.流动相中的其他组分 E.流动相中的其他组分

一、HPLC方法建立过程中的常见问题 HPLC方法建立过程中的常见问题对HPLC方法的所要达到的目标不明确 (如可能检测到多少个杂质，检测到什么水平) 对杂质的相关工作太粗 (杂质的ID,响应因子，杂质是否会在体系中进一步降解等) 方法建立时选择的样品不合适 (如选择了精制后的样品) 没有注意样品的处理方法 (如超声/在溶剂中的降解过程/进入色谱柱后发生水解等) 没有考虑色谱柱能否长期满足系统适应性的要求 (同一色谱柱的耐用性，不同色谱柱的等同性等) 方法建立之前，没有进行产品的降解实验3

二、HPLC 建立的一般程序合成人员： 合成人员： 介绍产品的合成路线/产品的性质(如产品的酸碱性、稳定性等) 推断产品相关杂质的结构和极性等 合成或分离得到相关杂质

分析人员： 分析人员： 参考文献(如chromatography,bio-pharmaceutical analysis) 选择色谱柱/选择流动相/选择合适的检测器和参数 LC-MS确认杂质的数量 条件优化(流动相种类，比例等) 项目的专属性 方法验证4

循环

三、色谱条件的建立

样品结构特征 样品种类 样品的溶解度及稳定性 样品信息 含有的杂质数目和性质 样品的PKa值

色谱条件优化 的依据分析时间 分离度 理论塔板数 拖尾因子 灵敏度 合理的系统适应性指标具有非常重要的意义。5

分离目标

3.1色谱柱的选择 3.1色谱柱的选择A.色谱柱的归类 A.色谱柱的归类低极性 非离子 中高极性 Mw<2000 阴离子 离子 反相HPLC 阴离子交换、离子排斥、 离子对 阳离子交换、离子对 正相HPLC

样 品阳离子

水溶性 Mw >2000 脂溶性

凝胶过滤色谱 凝胶渗透色谱

B. C18色谱柱的性能影响因素 色谱柱的性能影响因素 硅胶纯度--- 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度 硅胶纯度

物 理 性 质

色谱柱尺寸--- 填料床的长度和内径 色谱柱尺寸 颗粒形状--- 球型或不规则型 颗粒形状 粒径--- 平均颗粒直径,通常3-10µm

粒径 表面积--- 颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以m2/g表示 表面积 孔径--- 颗粒的孔或腔的平均尺寸, 范围80-300Å 孔径

B. C18色谱柱的性能影响因素 色谱柱的性能影响因素 键合类型--- 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 键合类型 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连 碳覆盖率---与基体物质相连的键合相的量 碳覆盖率 封端---键合步骤之后,用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来 封端CH3 OH + X Si (CH2)17CH3 CH3monomeric bonding

化 学 性 质

R Si (CH2 )17 CH3 R

OH + OH

CH3polymeric

Obonding

CH3 Si (CH2)17 CH3

X Si (CH2 )17CH3 X

O

Column Selection ChartSuitable for MW >2000 High Resolution High Sensitivity High Efficiency Low Backpressure Stability at pH Extremes High Capacity High Stability Low Mobile Phase Consumption Fast Analysis High Sample Loadability Fast Eqilibration Default Column (Good for most Applications)

Particle Size small (3µm) medium (5µm) large (10µm) Column Length short (30mm) medium (150mm) long (300mm) Column ID narrow (2.1mm) medium (4.6mm) wide (22.5mm) Surface Area low (200m2/g) high (300m2/g) Pore Size small (60Å) medium (100Å) large (300Å) Carbon Load low (3%) medium (10%) high (20%) Bonding Type monomeric polymeric Particle Shape spherical irregular

Method Goals

C. 固定相种类的选择 Step 1 画出所有需要分离的化合物结构，找出结构最相似的一组化合物.HO O HO OH O O OH HO

O

O

Prednisolone

Prednisone

Step 2 Functional Group Polarity ComparisonsPolarity Functional Group Structure Bonding Types Intermolecular Forces Displayed

Low

Methylene Phenyl Halide Ether

R (CH2 )2

σ σ,π σ σ

London London London, Dipole-Dipole London, Dipole-Dipole, H-bonding

RR F, Cl, Br, I

R

OO-

R

Nitro Ester Aldehyde

R

N O

+

σ,π σ,π σ,π σ,π σ,π σ σ,π

London, Dipole-Dipole, H-bonding London, Dipole-Dipole, H-bonding London, Dipole-Dipole, H-bonding

O R O R OR H O

Ketone Amino Hydroxyl High Carboxylic Acid

R R

London, Dipole-Dipole, H-bonding London, Dipole-Dipole, H-bonding, London, Dipole-Dipole, H-bonding London, Dipole-Dipole, H-bonding,

R

NH2

R

OH

O R OH

Step3 固定相的作用力类型C18 (ODS)/C8/C4 非极性 色散力作用,疏水性 色散力作用 疏水性 碳链越长,极性越弱 碳链越长 极性越弱 端基封尾的作用比较明显

3 CH

CH O3 CH

3

Si R3 CH 3 CH

OH OH OH OH

O

Si R3 CH 3 CH

+

CH3 Cl Si R3 CH

OH OH

+

OH

3 Cl Si CH 3 CH

3 O Si CH 3 CH 3 CH

R = C8, C18,etc.

O Si R3 CH

(TMS)

O Si R12

Step3 固定相的作用力类型 苯基柱非极性 色散力作用+ 相互作用 色散力作用 π - π 相互作用 杂环化合物和芳香类化合物有独特的选择

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