雷帕霉素促进自噬并降低神经组织损伤和脊髓损伤后运动功能障碍(2)

Fig. 2A 基于频带密度分析，在损伤后24 h，雷帕霉素处理组（2.318 ±

0.866）p70S6K的磷酸化水平显着低于溶剂对照组（8.773±1.083），和假手术对照组（10.000±1.794）（分别取P值= 0.002和0.005）(Fig. 2B)。

Fig. 2

损伤后第3天，三组间p70S6K的磷酸化水平，没有表现出任何统计学的差异。

LC3表达的免疫组化和Western blot分析

为了检测雷帕霉素治疗后的自噬活性，对LC3进行免疫组织化学染色，并对LC3-阳性细胞的数目进行计数。与假手术对照组相比，雷帕霉素处理组和溶剂对照组的小鼠细胞LC3的表达量增加(Fig. 3A–I,S)。雷帕霉素处理组的小鼠表达LC3的细胞数量明显高于溶剂处理组。高倍显微镜显示，表达LC3的细胞中显示的点状LC3的位于细胞质中(Fig. 3J–R)。与假手术对照组相比，雷帕霉素处理组和溶剂处理组小鼠LC3-阳性细胞的数目显着增加（分别为P 值= 0.012和<0.001）。此外，雷帕霉素处理组LC3-阳性细胞数目显著高于溶剂处理组(p = 0.018) (Fig. 3T)。在Western印迹分析中，雷帕霉素处理组LC3-II的蛋白的表达高于与赋形剂处理组和假手术对照组(Fig. 4A)。

在条带分析中，雷帕霉素处理组（7.274±0.783）LC3-II的表达水平

显著高于假手术对照组（1.000±0.380）和赋形剂处理组小鼠（4.717

（分别取P值=0.002和0.001）。此外，雷帕霉素处理组LC3-II ±0.532）

的表达显著高于赋形剂处理组（p值=0.035）(Fig. 4B)。

Fig. ３

Fig. 4 Beclin1表达的免疫组化和Western blot分析

为了研究自噬活性，我们也对Beclin 1的表达进行免疫组化检测，并计数Beclin 1的阳性细胞。与假手术对照组相比，雷帕霉素处理组和溶剂对照组小鼠表达Beclin 1的细胞数明显增加(Fig. 5A–I,S)。与假手术对照组相比，雷帕霉素处理组和溶剂对照组小鼠Beclin 1阳性细胞数明显增加（分别取p值=0.005，和<0.001）(Fig. 5T)。

Western印迹分析结果显示，与假手术对照组相比，雷帕霉素处

理组和溶剂对照组小鼠细胞表达Beclin 1蛋白的量显著增加(Fig. 6A, B)。条带密度分析显示，与假手术对照组（1.000 ±0.594）相比，雷帕霉素处理组（7.411±0.882）和溶剂对照组（6.506 ±0.609）小鼠细胞表达Beclin 1蛋白的量显著增加（分别取p值<0.001和0.001）。此外，与假手术对照组相比，雷帕霉素处理组Beclin 1的表达相对较高，但没有显著增加。

Fig. 5

FIG.6. 未受损白质区

为了研究脊髓损伤后不同损伤区脱髓鞘作用的不同，对雷帕霉素处理组和溶剂处理组的未受损白质区使用luxol fast蓝染色进行对比。雷帕霉素处理组未受损白质区范围明显大于溶剂处理组，正如应用 luxol fast蓝染色对损伤周围切片染色的结果所示(Fig. 7A,B)。雷帕霉素处理组白质区受保护程度高于溶剂处理组，特别是在背侧的脊髓(Fig. 7B)。对未受损白质区的定量分析显示，在受损伤中心头

Fig. 7A,B

端和尾端> 500微米的范围，雷帕霉素处理组未受损白质区的平均值

虽不是显著大于溶剂处理组但始终高于溶剂处理组(Fig. 7C)。

Fig. 7C NeuN阳性细胞数

为了研究损伤后的神经细胞损失，应用免疫组织化学染色的方法对雷帕霉素处理和溶剂处理组NeuN阳性细胞的数目进行比较。溶剂处理组NeuN阳性细胞的数目稀少。相反，与溶剂处理组相比，雷帕霉素处理的小鼠NeuN阳性细胞的数目更高(Fig. 8A–M)。脊髓损伤后42天内，雷帕霉素处理的小鼠NeuN-阳性细胞的数量显著高于溶剂对照组（p值=0.012）(Fig. 8N)。

Fig. 8 TUNEL阳性细胞数

为了探讨脊髓损伤后，雷帕霉素对细胞死亡中的效应，我们进行TUNEL染色，并对雷帕霉素处理组和溶剂处理组小鼠TUNEL阳性细胞的数量进行比较。在伤后3天获得的切片TUNEL染色中发现，与赋形剂处理的小鼠相比，雷帕霉素处理的小鼠TUNEL阳性细胞明显减少(Fig. 9A–M)。对TUNEL阳性细胞计数发现，与赋形剂处理的小鼠相比，雷帕霉素处理的小鼠TUNEL阳性细胞明显减少( p = 0.008) (Fig. 9N)。

Fig. 9

讨论：

在本研究中，我们证实了雷帕霉素的应用显著降低了损伤脊髓组织中p70S6K的磷酸化以及LC3和Beclin 1的高表达。此外，与溶剂处理组相比，雷帕霉素处理组小鼠的受损脊髓组织中神经元丢失和细胞死亡显著减少。此外，雷帕霉素处理过的小鼠运动功能的BMS 评分明显高于溶剂处理组小鼠。这些结果表明，SCI后，应用雷帕霉素抑制mTOR信号转导通路提高自噬水平，减少了神经组织损伤和运动功能受损。本研究表明，雷帕霉素对脊髓损伤后的神经具有保护作用。以往的研究表明，在多种神经变性疾病中应用雷帕霉素抑制mTOR信号通路，将激活细胞自噬(Pan et al., 2008; Ravikumar et al.,

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