微生物思考题及参考答案(2)

25. 配制牛肉膏蛋白胨培养基，有哪些操作步骤？那几步易出错，如何防止？称取药品—加热溶化—分装—加棉塞—包扎—灭菌—搁置斜面易出错的步骤有：

a 称取药品称取时钥匙专用，瓶盖不要错盖，易吸水的药品要快速称取；

b 加热溶化加入药品后要用玻璃棒不停搅拌，以免糊底（在琼脂熔化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器，同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。）；

c 分装分装时培养基不能粘在三角瓶（或试管）口，以免接种时染菌；

d 搁置斜面斜面长度约试管长度一半为宜。

26. 平板菌落计数法的原理是什么? 它适用于那些微生物的计数？平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。（但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的

2~3 或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。现在常使用菌落形成单位）。

平板计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个微生物繁殖而形成的现象进行的，也就是一个菌落可代表一种微生物（并不绝对）。通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。

8、微量移液器的最小量程太大，在加样时，容易加多，使盖玻片鼓起，血球计数板所技术的体积变大，最终结果偏大。改进：用量程的小的微量移液器并少加一些。

27. 如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产生高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？写出实验方案（产蛋白酶菌株在酪素平板上能形成降解酪素透明圈）。

以下试验方案有关操作均遵循无菌操作条件

一材料准备 1 土壤【有机质（特别是蛋白质）含量丰富的土壤】

2 灭菌生理盐水（0.85%NaCl）

3 灭菌移液管

4 添加酪素的B—4（牛肉膏蛋白胨完全培养基）经灭菌

5 B —4 斜面（经灭菌）

6 其他材料：接种环酒精灯等

二操作方法

1 在盛有10ml 灭菌生理盐水的烧杯中添加1g 土壤，配成悬浮液；

2稍静止后，用灭菌移液管移取部分上清液，将其制成10A4 —10A6倍的稀释液；

3 用灭菌移液管吸取各稀释液用稀释倒平板法（或涂布平板法）将其接入添加酪素的B —

4 平板上；

4在55—65C下培养1 —2天；

5挑取形成降解酪素透明圈的菌落（透明圈直径D与菌落直径d之比较大者），转接入B—4 斜面上培养；（若无特定菌落形成，则需另取土样从开始重复试验）

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6 将B—4 斜面上的菌落再用平板纯培养，依次重复2—3 次后即可得到纯培养（镜检）；

7 纯培养细菌中蛋白酶的提取及活性鉴定【摇瓶培养（若提取蛋白酶及其活性正常，则纯培养成功，否则，重取土样重复以上实验）】。

28. 为什么熔化后的培养基要冷却至45C左右才能倒平板？

低于这个温度琼脂会凝固，温度过高，如果是做倾倒琼脂做菌落计数，会杀死一部分细菌，如果只是只是制备琼脂平板，那么温度太高就进行倾倒会导致琼脂凝固后偏软，水汽过多。

29. 要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？

1 无菌操作

2 稀释良好，不会太浓或太稀。

3 菌落生长时间控制好，不会长的太大不便区分，也不至于太小影响计数。

30. 当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪

里？

1.太浓

2. 没涂匀

31. 用倾注法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间

（48h）后观察结果？

倾注法是在培养皿中接种好样品之后，倾注琼脂并培养；而涂布法则是在琼脂表面接种并使用L 型棒涂布。

因此，倾注法的菌落将出现在琼脂的各个部位，包括底层和中层，但涂布法培养后形成的菌落只出现在琼脂表面。

32. 你如何解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？

答：①淀粉是大分子物质，进入细胞十分困难，甚至需要高耗能的胞吞作用。因而通过胞外酶的作用，将淀粉水解为葡萄糖后运入细胞，较方便高效。

②试验中出现透明圈，说明培养基内淀粉被水解，可推测是细菌产生的胞外的淀粉酶起的作用。

33. 不利用碘液，你能否证明淀粉水解的存在? 答：由于淀粉水解生成葡萄糖，即多羟基醛，因此可利用醛的性质进行检验，如银镜试验，斐林试验等。呈阳性者，说明产生了葡萄糖，淀粉被水解；阴性者说明淀粉未被水解。

34. 假如某些微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？答微生物有氧代谢葡萄糖产气不产酸，因此发酵结果是小管中生气泡但是溶液不变黄。

35. 解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？答：化学原理：有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。因为丙酮酸是生物体呼吸作用的产物，无论是有氧还是无氧，都会产生丙酮酸，因而无法作为色氨酸酶活性的指示剂进行区分。

同时吲哚能通过有明显颜色变化的化学反应观测到，而丙酮酸不能，所以试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸。

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36. 为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气杆菌为阴性？答：当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（PH6.3）转变为红色（PH4.2）,即甲基红反应。而大肠杆菌和产气肠杆菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养的后期仍能维持酸性PH4,而产气肠杆菌则转化

有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使PH升至大约6。因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。

37. 用紫外线进行诱变时, 为什么要打开皿盖?为什么要在红光灯下操作紫外线不容易穿透玻璃，所以打开盖，自然光下容易光复活，红光下不会所以在红光下操作

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