在 pH 5.0，9.5和11. [1]
40、下列蛋白质的混合物在什么 pH 值时电泳，分离最为有效?(1)血清清蛋白和血红蛋白；(2)肌红蛋白和胰凝乳蛋白酶原；(3)卵清蛋白、血清清蛋白和脲酶。[2]
41、指出下列蛋白质在分离范围为 5000~400000的凝胶过滤柱上洗脱下来的先后顺序。肌红蛋白、过氧化氢酶、细胞色素C、肌球蛋白、胰凝乳蛋白酶原和血清清蛋白。[3] 42、若细胞色素C，β-乳球蛋白，一种未知蛋白质和血红蛋白用凝胶过滤分离时，其洗脱液体积分别为118、58、37与24ml，试问未知蛋白质的相对分子质量。(假定所有蛋白质都是球形的，相对分子质量都在凝胶过滤的分级分离范围内。) [4]
1
39、根据各种蛋白质的pI，从而判断在电场中的移动方向。现总结如下：
蛋白质 卵清蛋白 β-乳球蛋白
pI 4.6 5.2
移动方向
pH5.0 pH7.0 pH9.5 pH 11 A C C
A
O
A
胰凝乳蛋白酶原 9.5
2
40、(1)血清清蛋白 pI＝4.9，血红蛋白pI=6.8， (4.9 + 6.8)/2 ＝5.85 动。
在pH 5.85时电泳，分离最为有效。点样时样品点在中间，血清清蛋白向阳极移动，而血红蛋白向阴极移(2)肌红蛋白 pI ＝7.0，胰凝乳蛋白酶原 pI＝9.5， (7.0 + 9.5)/2＝8.25
在 pH 8.25时电泳，分离最为有效，点样时样品点在中间，肌红蛋白向阳极移动，而胰凝乳蛋白酶原向阴极移动。
(3)卵清蛋白pI＝4.6，血清清蛋白pI＝4.9，脲酶pI＝5.0。在pH 4.9 时电泳，分离最为有效，样品占在中间，学期清蛋白留在原点，卵清蛋白向阳极移动，脲酶向阴极移动。
3
41、凝胶过滤是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效的方法之一。相对分子质量大的比相对分子质量小的先被洗脱下来。根据各蛋白质的相对分子质量，从而知洗脱下来的先后次序为：肌球蛋白，过氧化氢酶，血清清蛋白，胰凝乳蛋白酶原，肌红蛋白，细胞色素C。
4
42、通常可用作图法。首先依据题中所给条件(即表3-6中的数据)在半对数坐标纸上以相对分子质量对数对洗脱液体积作图，画出标准曲线(图3-11)。然后从标准曲线上查V＝37ml处的相对分子质量，从图3-11求得来知蛋白质的相对分子质量约为52000。
表3-6 蛋白质的相对分子质量和洗脱液的体积 蛋白质 细胞色素C β-乳球蛋白 血红蛋白 相对分子质量 13370 37100 64500 洗脱液体积/ml 118 58 24 43、用增加盐离子强度的方法，从指定的离子交换柱上洗脱下列蛋白质，指出它们被洗脱下来的先后顺序，并说明其理由：(1)细胞色素C，溶菌酶，卵清蛋白，肌红蛋白(阴离子交换柱)：(2)细胞色素C，胃蛋白酶，脲酶，血红蛋白(阳离子交换柱)。[1]
44、扼要解释为什么大多数球状蛋白质在溶液中具有下列性质。(1)在低 pH 值时沉淀。(2)当离子强度从零逐渐增加时，其溶解度开始增加，然后下降，最后出现沉淀。(3)在一定的离子强度下，达到等电点 pH 值时，表现出最小的溶解度；(4)加热时沉淀。(5)加入一种可和水混溶的非极性溶剂减小其介质的介电常数，而导致溶解度的减小。(6)如果加入一种非极性强的溶剂、使介电常数大大地下降会导致变性。[2]
45、凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳这两种分离蛋白质的方法均建筑在分子大小的基础上，而且两种方法均采用交联的多聚物作为支持介质，为什么在凝胶过滤时，相对分子质量小的蛋白质有较长的保留时间，而在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它又―跑‖得最快? [3]
1
43、离子交换柱层析主要根据物质所带的电荷不同而予以分离。一个蛋白质带的负电荷越多，它与阴离子交换剂结合愈紧密，而与阳离子交换剂的结合能力愈弱。
(1)细胞色素C的pI=10.6，溶菌酶pI=11.0，卵清蛋白pI＝4.6，肌红蛋白pI＝7.0。所以洗脱的先后顺序为溶菌酶，细胞色素C，肌红蛋白，卵清蛋白(阴离子交换柱)。
(2)细胞色素C的pI＝10.6，胃蛋白酶pI＝1.0，脲酶pI＝5.0，血红蛋白pI＝6.8。所以洗脱的先后顺序为：胃蛋白酶，脲酶，血红蛋白，细胞色素C(阳离子交换柱)。
2
44、(1)在低pH值时，羧基质子化，这样蛋白质分子带有大量的净正电荷，分子内正电荷相斥使许多蛋白质变性，并随着蛋白质分子内部疏水基团向外暴露使蛋白质溶解度降低，因而产生沉淀。
(2)加入少量盐时，对稳定带电基团有利，增加了蛋白质的溶解度。但是随着盐离子浓度的增加，盐离子夺取了与蛋白质结合的水分子，降低了蛋白质的水合程度，使蛋白质水化层破坏，而使蛋白质沉淀。 (3)在等电点时，蛋白质分子之间的静电斥力最小，所以其溶解度最小。
(4)加热会使蛋白质变性，蛋白质内部的疏水基团被暴露，溶解度降低，从而引起蛋白质沉淀。
(5)非极性溶剂减小了表面极性基团的溶剂化作用，促使蛋白质分子之间形成氢键，从而取代了蛋白质分子与水之间的氢键。
(6)介电常数的下降对暴露在溶剂中的非极性基团有稳定作用，结果促使蛋白质肽链的展开而导致变性。
3
45、凝胶过滤常用的是葡聚糖凝胶(Sephadex)，这凝胶颗粒的交联介质排阻相对分子质量较大的蛋白质，仅允许相对分子质量较小的蛋白质进入颗粒内部，所以相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶颗粒之间的空隙中通过。这意味着它通过柱的体积为床体积减去凝胶颗粒本身所占的体积。而相对分子质量小的蛋白质必须通过所有的床体积才能流出，所以，相对分子质量小的蛋白质比相对分子质量大的蛋白质有较长的保留时间。
46、在一抽提液中含有三种蛋白质，其性质如下：
蛋白质 相对分子质量 等电点 A B C
20000 21000 5000
8.5 5.9 6.0
试设计一个方案来分离纯化这三种蛋白质。[1]
47、有一蛋白质，在某组织内含量较低，很难分离纯化。现已知其相对分子质量，并已有该蛋白质的抗体，问哪些实验方法可以初步证实组织内的确含有该蛋白质? [2]
五、计算题
1、计算下列溶液的 pH 值：(1) 0.1mol/L Gly与0.05mol/L NaOH 的等体积混合液。(2) 0.1mol/L Gly与0.05mol/L HCl 的等体积混合液. [3]
2、(1)欲配制100ml pH 2.4，0.3mol/L 甘氨酸-HCl 缓冲液，需多少质量的甘氨酸(相对分子质量 75.07。pKa1＝2.4，pKa2＝9.6)和多少体积的 1mol/L HCl?
(2)欲配制 100ml pH 9.3，0.3mol/L 甘氨酸-NaOH缓冲液，需多少质量的甘氨酸和多少体积
而SDS-聚丙烯酰胺胶凝胶电泳时，其凝胶介质并不存在像Sephadex那样的颗粒之间的空隙。所以，所有的蛋白质分子必须全部通过这交联介质而移动。蛋白质的相对分子质量愈小，通过这介质就愈快，移动得愈迅速。
1
46、由于蛋白质A、B与蛋白质C的相对分子质量相差较大，可用凝胶过滤的方法将蛋白质A、B与蛋白质C分开并纯化；又由于蛋白质A与B等电点不同，可用离子交换柱层析将蛋白质A与B分开并纯化。
23
47、先进行蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后再进行蛋白质印迹，最后用抗体酶联检测。
1、(1)Gly和NaOH的反应为
H3N-CH2-COO- + NaOH → H2N-CH2-COONa + H2O
Gly± Gly-
0.1mol/L Gly与 0.05mol/L NaOH 等体积混合后 [Gly-] ＝[OH-] ＝0.05/2 ＝ 0.025 (mol/L)
+
[Gly±] ＝(0.1-0.05)/2 ＝0.025 (mol/L)
此时溶液中有如下平衡：
根据公式 pH ＝ pKa + lg（[质子受体]/[质子供体]） 混合后溶液的pH值为
pH ＝ pKa2 + lg([Gly-]/[Gly±]) = 9.6 + lg(0.025/0.025) = 9.6 (2)Gly 和 HCl的反应为： +
H3N-CH2-COO- + HCl → +H3N-CH2-COOH + Cl-
Gly± Gly+
0.1mol/L GLy 与 0.05 mol/L HCl 等体积混合后 [Gly+] ＝ [H+] ＝ 0.05/2 ＝0.025(mol/L) [Gly±] ＝(0.l - 0.05)/2 ＝0.025(mol/L) 此时溶液中有如下平衡：
根据公式 pH ＝ pKa + lg（[质子受体]/[质子供体]） 混合后的溶液为
pH ＝ pKa1 + lg([Gly±]]/[Gly+) = 2.34 + lg(0.025/0.025) = 2.34
的 1mol/L NaOH? [1]
3、制备 1L pH 3.2，0.1mol/L 甘氨酸缓冲溶液, 需0.1mol/L 甘氨酸盐酸盐(Cl-+H3N-CH2-COOH)和0.1mol/L 甘氨胺(+H3N-CH2-COO-)各多少? [2]
4、应该加多少克 NaOH 到500ml 已经完全质子化的 0.01mol/L 组氨酸溶液中，才能配成 pH 7.0 的缓冲液?(咪唑基 pK＝6.0，NaOH 相对分子质量为40) [3]
5、(1)赖氨酸ε-氨基的 pKa 为10.5，在 pH 9.5 的赖氨酸稀溶液中，ε-氨基中有多少被质子
1
2、(1)甘氨酸和HCl的反应为: +H3N-CH2-COO- + HCl → +H3N-CH2-COOH + Cl-
pH =pKa1 + lg([Gly±]/ [Gly+] , pH = 2.4 pKa1 = 2.4
代入上式： 2.4=2.4 + lg([Gly±]/ [Gly+])， lg([Gly±]/ [Gly+])=0， [Gly±]/ [Gly+]=1 因为， [Gly±]= [Gly+]， [Gly±] + [Gly+]=0.3mol/L，所以，[Gly±]= [Gly+]=0.15 mol/L 需甘氨酸的质量为0.3 3 100/1000 3 75.07 = 2.25(g) 需1mol/L HCl 体积为 0.15 3 100/1 =15(ml)
(2)甘氨酸和NaOH的反应为： +H3N-CH2-COO- + NaOH → H2N-CH2-COONa + H2O
pH =pKa2 + lg([Gly-]/ [Gly±]) , pH = 9.3 pKa2 = 9.6
代入上式： 9.3 = 9.6 + lg([Gly-]/ [Gly±]])， lg([Gly-]/ [Gly±])=-0.3， [Gly-]/ [Gly±]= 0.501
因为， [Gly-]= 0.501[Gly±]， [Gly-] + [Gly±]=0.3mol/L，所以，[Gly-]= 0.1mol/L [Gly±]=0.2 mol/L 需甘氨酸的质量为0.3 3 100/1000 3 75.07 = 2.25(g) 需 1mol/L NaOH 的体积为 0.1 3 100／1＝10(ml) 2
3、甘氨酸盐酸盐(Cl- +H3N - CH2 - COOH )实际上为二元酸，它的解离式为
pH =pKa1 + lg([Gly]/ [Gly]，3.2 = 2.34 + lg([Gly]/ [Gly+]，lg([Gly±]/ [Gly+]) = 3.2-2.34 = 0.86，[Gly±]/ [Gly+] = 7.24
因为配制甘氨酸缓冲溶液所用的甘氨酸盐酸盐和甘氨酸的原始浓度相同，都是 0.1mol/L，所以它们的浓度
±
+
±
之比就是它们所用的体积之比：VGly已知缓冲液总体积为1L，VGly??VGly???7.24 ，
（1-VGly)?7.24VGly??0.879，
VGly??1?0.879?0.121(L)
所以要制备1L pH 3.2 的1mol/L 甘氨酸缓冲液需0.1 mol/L 甘氨酸0.879L。
3
4、用以下简式表示His的解离：
为了配制 pH 7.0 的缓冲液，必须加入NaOH来中和其羧基全部解离放出的H+和咪唑基部分解离放出的H+。
在pH 7.0 时，羧基几乎全部解离，中和羧基放出的 H+ 所需NaOH的质量为W克。 500 3 0.01 = W/(40／1000) W＝0.20(g)
在pH 7.0 时，咪唑基部分解离，根据Henderson-Hasselbalch方程可算出有多少咪唑基解离放出H+。
±±
pH ＝pK2 + lg([His]／[His+])
±±
7＝6 + lg([His／[His+])
±±
[His／[His+] = 10，即10/11的咪唑基解离放出H+。
所以中和咪唑基上放出的H+所需NaOH的质量为： 0.2 3 10／11 ＝ 0.18(g) 所需加入NaOH的总量为 0.20 + 0.18 = 0.38 （g）
因此要加入0.38g NaOH 到 500m1 完全质子化的 0.01mol/L 组氨酸溶液中才能配成pH值为 7.0 的缓冲液。
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