基因工程复习资料

细菌的限制—修饰作用

核酸限制性内切酶的类型及主要特性

一个单位的限制性核酸内切酶定义为：在合适的温度和缓冲液中，在50uL反应体系

中，1h完全降解1ug底物DNA所需要的酶量。

星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，内切酶出现切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称为星号（*）活性。

同位酶：识别位点相同，但切点不同。

同裂酶：识别位点和切点均相同，但来源不同。

同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端

两种DNA连接酶

（1）大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端。分子质量为68ku

（2）T4噬菌体DNA连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接平齐末端。分子质量为75ku

p35页表2-4

简述DNA连接酶的作用机制及其特点

说明使用切口位移法进行DNA标记的原理及其步骤

基因工程载体根据来源和性质不同可分为质粒载体，噬菌体载体，黏粒载体，噬菌粒载体，病毒载体，人工染色体等

质粒的概念：质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状（线型质粒DNA 分子 — 眼虫、衣藻等）双链DNA 分子（酵母的“杀伤质粒”是RNA），可自身复制和表达。

共价闭合环状DNA（SC构型）开环DNA（ oc构型） 线形DNA （L构型） 同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。

理想质粒载体的必备条件：

A、具有较小的分子质量和较高的拷贝数

B、具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点（多克隆位点） C、具有两种以上的选择标记基因

D、缺失mob基因（载体的安全性：质粒不能随便转移、条件致死突变） E、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达（复制起点）、较小的宿主范围

蓝白班筛选原理

穿梭质粒载体(shuttle vector) ：由人工构建的具有两种不同复制子起点和选择性标记基因

黏粒载体 也称柯斯质粒载体：它是一类含有λ噬菌体的cos序列的质粒载体

噬菌体载体的优越性p69

黏粒载体的基本特点 (P70)

具有λ噬菌体的特性(体外包装，高效感染等)；

具有质粒载体的特性(易于克隆操作、选择及高拷贝等)； 具有较高容量（35kb-45 kb）的克隆能力； 具有与同源性序列的质粒进行重组的能力。

表达载体构建的一般原则

1. 阅读框架与外源基因高效表达 2. 启动子与外源基因高效表达

3. 转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达 4. 有效的翻译起始与外源基因高效表达 5. 终止密码子选择与外源基因高效表达 6. 外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达

报告基因：用于检测与其组装在一起的嵌合基因在导入细胞后是否表达的一种指示基因 探针：指经放射性或放射性物质标记的已知或特定的DNA或RNA序列 p115第八题

PCR引物设计的一般原则：

① 引物长度一般在15~30碱基之间，Tm接近72℃较佳。

② 碱基要随机分布，避免出现一连串的单一碱基或产生 二级结构。 ③ G+C含量在45%~55%之间。

④ 两个引物在3′端均必须与模板互补， 5′端可以不互补。 ⑤ 引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免形成发夹结构。 ⑥ 引物之间不能有连续4个碱基的互补，以免形成引物二聚体。

⑦ 引物末位最好选A/G/C，不要选T，引物3′端要避开密码子的第3位。

反转录PCR（RT-PCR)：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。

快速扩增cDNA末端技术：PCR用于扩增代表mRNA转录物某单一位点与其3’或5’末端之间区域的部分cDNA称为快速扩增cDNA末端技术

基因文库：用分子克隆方法将某种生物或其组织的所有DNA片段插入适当的载体，转化适当宿主菌后，进行保存的克隆集合。 p141

cDNA文库的构建：以mRNA为模板，将体外反转录的cDNA、与适当的载体连接后转化受体菌，这种包括特定组织细胞所有mRNA信息的cDNA克隆的集合称为该组织细胞的cDNA文库

cDNA第二链的合成（作业p154）

化学合成DNA方法有：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、自动化合成法 固相合成 从基因文库中获取目的基因的方法有 核酸杂交法 差示杂交法 PCR筛选法 表达文库的免疫学筛选

染色体步移的基本过程

1) 用遗传作图将目标基因定位在染色体的特定位置; 2) 找到与目标基因紧密连锁的分子标记;

3)构建含有大插入片段的基因组文库(ＢＡＣ库或ＹＡＣ); 4)以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库; 5)用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群; 6)通过染色体步行获得含有目标基因的大片段克隆; 7)通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆;

同聚物加尾法：DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。

人工接头连接法p168

外源DNA片段与载体DNA的重组主要有哪几种方法？各有何优缺点？ （一）黏性末端连接法

（二）平头末端连接法： ① 同聚物加尾连接； ②人工接头连接等。

黏性末端连接法优点： 黏性末端连接可抑制载体和目的DNA分子的自连，因而可大大提高连接的效率。 更重要是不同限制性酶切位点的黏性末端连接可以控制目的DNA和载体DNA的连接方向。

缺点：载体易自身环化；不易定向克隆；产生串联重组体；难以插入特定的基因；大片段DAN的重组率低

DNA接头 （adapter）连接法优点：连上后就能用。

缺点：接头与接头以粘末端连接，形成二(多)聚体，影响与DNA片段的连接 同聚物加尾法优点：能把任何片段连接起来

缺点：操作繁琐；外源片段难以回收；同聚物尾巴影响外源基因表达。

转化子：就是导入外源DNA后或得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。

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