生物化学上册精要 (4)

的唯一方法。它可以确切地测定二级结构的种类，段数和位臵。此法很准确，但测定时间长，分析复杂，样品用量较大。

根据氨基酸序列预测，例如统计学方法 ：统计出各残基或二肽、三肢片段在有序结构中出现的频率，用以计算预测其形成二级结构的可能性

4．1．4 蛋白质组学

以细胞或组织的全部蛋白质（蛋白质组）或与一个特定的生物学机制相关的全部蛋白质（功能蛋白质组）的变化规律为基础研究生命现象的学科称为蛋白质组学。目前蛋白质组学的研究内容主要是蛋白质组数据库和比较蛋白质组学。 用蛋白质组学方法研究蛋白质折叠（Houry，1999年11月《Nature》）。 获得所有与GroEL结合的肽链（免疫共沉淀） 分离与GroEL结合的肽链（二维电泳） 肽链结构分析（50种） 数据库比较

结论：大肠杆菌近2500条新生多肽链只有近300种需要分子伴侣GroEL。这些蛋白质能与GroEL相互作用的关键结构特征是？ 用蛋白质组学方法研究酵母核孔复合体的结构（Rout） 鉴定完整的酵母核孔复合体所有能检测到的多肽 对全部多肽定位并定量（免疫电镜） 构造酵母核孔复合体

用蛋白质组学研究线虫生殖器发育（Walhout）（根据两个蛋白质相互作用，那么它们一般参与相同或相关的细胞活动）

用27个与线虫发育的蛋白质构造酵母双杂交系统 建立与线虫生殖发育相关的蛋白质相互作用图谱

研究酵母近6000个蛋白质之间相互作用（Nature，2002） 列阵筛选法（array screening）：6000个不同的酵母单克隆排列在微滴定板上，杂交，通过报道基因的表达鉴定存在相互作用的蛋白质。效果好。 文库筛选法。构成文库（含6000个不同的酵母cDNA），杂交，筛选鉴定阳性克隆。通量大。

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酶 (Enzyme)

5．1 学习提要

酶是活细胞产生的具有催化能力的物质。生物化学反应基本上都是酶催化的。绝大多数酶都是蛋白质。1982年，Cech发现rRNA催化RNA水解，出现“Ribozyme”（核酶）名词。和无机催化剂相比，酶催化具有易失活、高效和有选择性（专一性）等特点。

5.1.1 酶的表征 1．酶的分类与命名

所有的酶都可以按照其催化的反应来表征，这正是国际理论和应用化学联合会（IUPAC）的酶学委员会制定的酶分类系统命名的依据。因此每一个酶都有习惯名称、系统名称和系统编号（EC编号）。系统编号的第一个数字表示酶属于六大类中的某类（表5-1 酶的主要分类）。 表5-1 酶的主要分类 类别 1 2 3 4 5 6 名称 催化反应 反应通式 A2H + B ? A + B2H AB + C ? A + BC AB + HOH ? AOH + BH 氧化还原酶氧化还原反应 类 转移酶类 水解酶类 功能基团的转移反应 水解反应 裂合酶类 从底物上移去一个基团留下双ABC ? A=B + C ? 键的反应 异构酶类 合成酶类 同分异构体间的互变反应 A ? B 一切必须与ATP分解相偶联，X + Y + ATP ? XY 并由两种物质合成为一种物质+ ADP + Pi 的反应 2．酶的活力 酶的活力，即酶催化反应的能力可以用酶催化的反应的初速度来表征。用酶的活力单位计量酶的活力时，酶的活力单位定义为给定条件下酶催化的反应达到某速度水平所需的酶量。如果没有特殊规定，建议采用国际单位（IU），一个国际单位定义为最适条件下（25°C，最适pH）每分钟催化1umol/L底物发生转变所需的酶量。 3．酶的纯度

酶作为催化剂可以用比活（specific activity）比较酶的纯度。比活指每mg酶蛋白所有的总活力。

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5.1.2 酶的结构与功能的一般原则 1．酶的活性部位

酶的活性部位指酶分子中直接与底物结合并催化底物反应的部位，通常处于或靠近酶分子的表面，只占酶分子很小部分（１％～２％），组成活性中心的几个氨基酸残基在空间结构中是靠近的，但在一级结构中可能相距很远，甚至位于不同的肽链上。此外许多酶有非蛋白质组分，它们位于或靠近于活性部位，参与结合底物或催化，这样的组分被称为辅酶或辅基，其中辅基特指与酶的蛋白质部分以共价键结合的非蛋白质组分（见5.1.4）。 2．酶与底物的结合

酶与底物的结合表现出专一性，酶的高度专一性是酶的重要特征。以下是关于酶的专一性的解释 （1）诱导楔合假说

为了解释酶能催化正反方向的反应，１９６４年Ｋｏｓｈｌａｎｄ提出“诱导楔合”假说（ｉｎｄｕｃｅｄ?ｆｉｔ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ），即当酶分子与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子诱导，其构象发生有利于底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合进行反应。X-衍射和NMR方法已经证明自由酶和结合了底物的酶的构像是不同的。 （2）过渡态稳定说

一般而言，酶与底物的最适相互作用只发生在过渡态，专一性取决于酶结合的过渡态的稳定性。 （3）分子识别说

酶的活性部位的底物结合基团的特定排列决定了酶对底物的专一性。如果酶活性部位功能团按最适原则与底物形成各种弱相互作用，那么酶显然不能同其他底物作用。

3．酶的催化方式

酶提高反应速度的基本机制包括酶的活性部位结合底物后使底物产生邻近、轨道定向、应力等多种效应，它们增加反应物的有效碰撞，或者使受作用的化学键变形、削弱，或者使受作用的化学基团增加反应性，活性部位的催化基团可能提供共价催化（如亲核、亲电）、酸碱催化、络合催化等多种断裂键的方式。最终结果是稳定过渡态，使底物易于达到过渡态，降低反应活化能。 邻近效应：

由于酶与底物结合，导致底物和底物（如双分子反应）之间靠近，而使有效浓度得以极大的升高，从而使反应速度大大增加的一种效应。 定向效应：

指反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。 应力和形变：

由于酶的结合，使底物分子内敏感键的电子云密度改变，产生“电子张力”，导致分子形变的一种效应。

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酸碱催化：

指通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。一个氨基酸侧链作为酸碱催化剂的可能性依赖于其pKa和活性部位的环境pH。

组氨酸咪唑基的解离常数约为６.０，因此在接近于生物体液ｐＨ的条件下，即在中性条件下，有一半以酸形式存在，另一半以碱形式存在，即可作为质子供体，又可作为质子受体在酶反应中发挥催化作用。同时咪唑基接受质子和供出质子的速度十分迅速，其半衰期小于１０ｓ。由于咪唑基有如此特点，所以在很多蛋白质中Ｈｉｓ含量虽少，却占很重要地位。 共价催化

酶上负责催化的亲核基团释放电子，攻击底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加速。酶中常见的亲核基团有丝氨酸羟基，半胱氨酸巯基、组氨酸咪唑基等。 4．酶能大幅度降低反应活化能

可以用化学过渡态理论解释酶为什么能提高反应速率。化学反应历程表明存在过渡态（transition state）或活化态（activated state），即分子间有效反应的状态。过渡态分子具有高的自由能，化学反应进行必须克服自由能障（free energy \“）。由于诱导楔合，酶以一种类似过渡态但能量较低的构像结合反应物；酶活性部位结合基团的邻近和定向效应使反应基团处于最适位臵，降低了活化熵（-S?），有利于过渡态形成；过渡态与酶分子强结合降低了活化焓（?H ? ），有利于过渡态稳定。-S?或?H ?或两者共同导致反应速率的提高。

5.1.3 酶动力学

酶动力学研究反应速率和影响反应速率的各因素。 1、底物浓度对酶催化反应速度的影响 （1）酶的饱和现象和酶的中间产物学说

酶的饱和现象指酶催化反应速度随底物增加达到最大值后不再继续增加。对该现象的发现导致产生酶的中间产物学说，即，

k1 k2

S+E?ES?E+P

k -1

并推导出米氏方程 （2）米氏方程

v= Vmax[S]/Km+[S]

Vmax=最大反应速度，[S]=底物浓度，Km =米氏常数 （3）Km的意义

①Km是酶的特征常数，和酶浓度无关，和底物浓度无关，和酶的种类与底物

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的种类有关，即不同的酶的Km不同，酶对于不同的底物，各有特定的Km。 ②Km有两种表达式，平衡分析中，Km = k–1/k1 ，稳态分析中Km = （k –1+ k2）/k1，因此给定的条件下，可以用1/ Km比较酶对底物的亲和性，确定酶的最适底物。 （4）Vmax

根据米氏方程推导过程，V= k2 [E S] ，Vmax不是酶的特征常数。根据稳态分析，[ES]不随时间变化，即当[S]﹥﹥Km，所有的酶全部转换为ES，此时酶催化反应达到其最大速度。因此稳态分析可以给出Vmax。 kcat：转换数（ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｎｕｍｂｅｒ，ＴＮ），表示酶的催化效率，指单位时间内每个活性中心转换底物的分子数，或者一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，或每秒种每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数。当ES复合物快速解离时， kcat = k2。大多数酶对其天然底物的转换数的变化范围为每秒１到１0。 （5） Vm和Km的求法

Lineweaver-Burk Plots（双倒数作图）（1/v~1/[S]） 1/v= Km / Vmax [S] + 1/ Vmax 2． 其他因素对酶催化速度的影响

（1）最适pH：使酶具有最大活性的pH。 （2）最适温度：使酶具有最大活性的温度。 3．抑制剂对酶催化反应速度的影响 抑制剂指能降低反应速率的物质。 （1）不可逆抑制

不能消除的抑制称为不可逆抑制，这是因为抑制剂与酶形成共价连接，使酶失活，因此不能用透析、超滤等物理方法消除抑制。 不可逆抑制剂的类型：

烷化剂：碘乙酸（与巯基反应），TPCK（与His咪唑基反应） 有机磷： DFP（与丝氨酸羟基反应）

有机金属盐：有机汞，如对氯汞苯甲酸（与巯基反应） 氰化物、CO等：与Fe2+反应 （2）可逆抑制

可以消除的抑制称为可逆抑制。可逆抑制的三种基本类型：

竞争性抑制：随底物浓度增加，抑制率下降。最常见，一般为底物类似物引起的抑制。例如丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制，对氨基苯磺酰胺（一种磺胺药）对二氢叶酸还原酶的抑制

非竞争性抑制：抑制率不受底物浓度影响。如含某些重金属离子的巯基试剂、EDTA等所引起的抑制。

反竞争性抑制：随底物浓度增加，抑制率上升。 ① 竞争性抑制 ② 非竞争性抑制 （3）可逆抑制的动力学方程 I I I

+

E + S?ES?P+E ‖ EI

1/v= Km / Vmax [S]*（1+[I]/Ki） + 1/ Vmax

+ +

E + S?ES?P+E ‖ ‖ EI ESI

20

1/v=（1+[I]/Ki）* Km / Vmax [S]+ （1+[I]/Ki） / Vmax

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