生物化学上册精要 (8)

DNA双螺旋结构

DNA 是含两条多核苷酸的双螺旋分子。

Watson-Crick模型：两条多核苷酸链反向平行，彼此按A=T，G=C碱基配对形成氢键；两条链彼此缠绕，形成右手双螺旋（B型螺旋体直径 2 nm，碱基对距离0.34 nm ,螺距3.4 nm，10对 核苷酸/螺圈）；磷酸核糖骨架在外，碱基对平面垂直于核糖平面，即垂直于螺轴，并层叠堆积在内；螺旋体表面形成两条凹槽——-大槽（宽槽）和小槽（窄槽）。

碱基对之间的氢键形成：A=T和G=C，碱基上与氢键形成有关的最重要的功能团包括环氮、羰基和氨基。

稳定DNA双螺旋的作用力：碱基堆积作用，在DNA中，碱基对平面（嘧啶的平面和嘌呤的近平面）层叠，产生疏水性堆积作用，包括范德华力和偶极-偶极作用。它最大程度地减少DNA分子与水的接触，稳定其三维结构。 DNA双螺旋的其它形式：A型——右手双螺旋的碱基对平面与螺轴不垂直（倾斜20o）（碱基对距离0.28 nm , 螺距3.2nm，11对 核苷酸/螺圈）；Z型——左手双螺旋，重复单位为嘌呤-嘧啶（碱基对距离0.38nm，螺距3.5 nm，12对 核苷酸/螺圈）。 DNA三螺旋（H-DNA）：出现在多嘧啶/多嘌呤情况下，形成三链DNA，并形成三螺旋体，即2股嘧啶链夹1股嘌呤链或2股嘌呤链夹1股嘧啶链。 DNA构像家族：A型、B型、Z型和H-DNA统称为DNA构像家族，表明DNA构像是序列依赖性的。

DNA双螺旋结构的发现和意义——DNA双螺旋结构科学地解释遗传和变异，是分子生物学的垫基石。

（2）染色体DNA的拓扑结构

染色体中的DNA是紧密折叠的，这种致密构像统称为DNA超螺旋，可以用下述参数描述环状DNA超螺旋： ①连环数L （linking number）：双螺旋DNA中一链绕另一链的次数。 ②缠绕数T （twisting number）：双螺旋DNA的W-C螺旋数。

③超螺旋周数S（number of turns of supercoils）或扭曲数W （writing number）：

④超螺旋密度（?）： ?=W/T

环状DNA（开环、闭环）可以通过拓扑操作形成正超螺旋和负超螺旋： 正超螺旋（+），即增加右手螺旋圈，为抵消应力，环状DNA将出现左手扭曲； 负超螺旋（-），即减少右手螺旋圈，为抵消应力，环状DNA将出现右手扭曲； DNA超螺旋和解超螺旋均必需借助蛋白质的作用，这类蛋白质称为DNA拓扑异构酶。

I 型DNA拓扑异构酶：催化DNA两条链同时断裂和连接 II 型DNA拓扑异构酶：催化DNA一条链断裂和连接

溴乙锭：一种吖啶类化合物，插入到碱基对之间，减少DNA负超螺旋 2． DNA的性质

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溶于水：与分子磷酸核糖骨架在外有关。

酸性：生理pH带负电荷，主要与磷酸基团解离有关，

分子形状和分子量：DNA是最大的生物分子，分子量达到108~1012，其直径/长度（d/l）=10-7，，因此DNA水溶液具有高黏度；分子形状和分子量也影响DNA在超速离心和在密度梯度离心时的沉降行为。例如在超速离心时分子量相同，环状DNA的沉降速度大于线形DNA，在氯化铯密度梯度离心时（48小时），平衡后DNA的浮力密度与其碱基组成、分子构像有关，有高G+C的DNA其浮力密度较高，超螺旋>环状>线形。 正旋光性：与分子不对称性有关

紫外吸收：260nm有最大光吸收，与其碱基有关。

3．DNA的变性和复性

DNA解链称为DNA变性，解链DNA重新聚合称为DNA复性。高温、酸碱、有机溶剂、射线、脲、胍、甲酰胺均可引起DNA变性。 （1）DNA的热变性

①Tm：纯DNA的热变性是协同过程，变性发生在一个狭窄的温度范围，因此DNA热变性中，增色效应达到最大值一半时的温度，称为该DNA的熔点或解链温度，记为Tm。

②影响Tm的因素：G-C含量、DNA样品均一性、缓冲液的离子强度和pH。例如在标准条件（0.15mol/LNaCl//0.15mol/L柠檬酸钠）下，Tm=69.3+0.41（G+C） （2）DNA复性

复性机理：随机识别成核和拉链式聚合延伸

影响因素：DNA片段的大小、离子强度、DNA浓度、温度 复性动力学：复性过程是二级反应，即-dC/dt=kC2 附：Cot分析（时间浓度曲线）

-dC/dt=kC2 ? C/Co=1/（1+kCot），

其中，C= t时间末复性DNA的浓度， Co =变性DNA的起始浓度，t=复性时间 ，k=速度常数（与t、DNA片段大小有关）

因此通过Cot曲线可以定量测定复性速度和序列复杂度。 当C/Co=1/2，则Cot1/2=1/k

因为k与重复序列的碱基数N成正比，则 Cot1/2 ? N

即：可以通过Cot1/2曲线和分子量标尺定量测知DNA的长度和重复序列的拷贝数。

Cot曲线中的分子量标尺：单一顺序中碱基对数目与Cot1/2的关系。 4． DNA的功能 （1）DNA是遗传物质

格雷费斯实验，艾佛里实验和蔡斯-何西实验证明DNA是遗传物质。 （2）DNA是遗传信息载体

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DNA携带的遗传信息通过复制、转录与翻译得到传递和表达（分子生物学中心法则）

5．DNA序列的测定 DNA的测定策略（图） DNA片段序列测定

发展了Sanger的加减法（1975）与链终止法（1977）（chain termination method）；化学裂解法（Maxam-Gilbert Method） 其中的链终止法（用放射同位素标记）步骤如下：

新链合成反应。分四管进行，每管反应混合物含待测DNA（顺序未知）、寡聚核苷酸引物（顺序已知）、dNTPs（四种三磷酸核苷的混合物，其中一种含放射性P）和DNA聚合酶。

分别加入ddATP 、ddCTP 、ddGTP、 ddTTP 做抑制剂。随机进行链终止。 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA片段 放射自显影、读序

6．1．4 核糖核酸RNA RNA的结构特征

单链RNA可以在局部区域通过氢键，配对形成有环（loop）、臂（arm）、发夹（pin）等结构的复杂形状的分子。其中各tRNA均形成三叶草形的四臂三（或四）环结构，并由于内部氢键配对形成倒L型三级结构。 RNA的性质

类似DNA，但因分子量显著低于DNA和不具有完全双螺旋结构，在有关性质上和DNA存在明显差异。 RNA的生物学功能

核酸是RNA病毒的遗传物质。

核酸参与遗传信息的传递和表达。例如mRNA是DNA信使，tRNA是蛋白质构件-氨基酸的专运者，核糖体RNA组建核糖体。

某些小分子rRNA是生物催化剂，即核酶（Ribozyme）

核酸是许多功能超分子的重要的结构组分：例如核糖体、信号识别颗粒等，M1RNA是E.coli的RNaseI的组成成分，该酶参与转录的RNA的加工。 6．1．5 基因组学

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第7章 质膜转运蛋白和物质跨膜转运

7．1 学习提要

7．1．1 生物膜和物质跨膜转运 生物膜的结构

S．J．Singer和G.L.Nicolson(1972)的流动镶嵌模型 三种普遍的物质跨膜转运系统

分类依据是携带溶质的数目和转运方向： （1）单载（uniport） （2）对称载（symport） （3）逆载（antiport） 7．1．2 被动转运

不与ATP分解偶联的跨膜转运 1．被动跨膜转运的能学

研究溶质通过生物膜的脂双层的能量变化

简单扩散：没有转运蛋白协助，溶质自行完成的扩散过程。由于去掉水化层过程是高度吸能的，故扩散通过脂双层的活化能很高。 促进扩散（facilitated diffusion）：有转运蛋白协助的扩散，转运蛋白与去水化的溶质非共价作用，取代与水的氢键。提供亲水的跨膜通道，减少溶质跨膜扩散的活化能。

2．转运蛋白（transpoter）

执行被动转运（passive transport）的蛋白质称为转运蛋白或通透酶（permiase），作用方式类似酶。具有高扩散速度、饱和性和专一性。不能使胞内浓度超过胞外浓度。 离子通道（ion channel）：

一类负责转运离子的转运蛋白，离子通道是由蛋白质单位聚合形成的跨细胞膜的结构，离子通道对离子有选择性。如Ca2+通道，K+通道、Na+通道等。在神经细胞、肌肉细胞等兴奋性细胞中，钙、钾或钠通道等的变化可引起膜两侧的电荷分布改变和电位变化，产生动作电位和引起神经递质释放。在分泌细胞中钙通道改变可引起离子的浓度变化，从而导致细胞一系列蛋白质结构发生变化。

葡萄糖通透酶（glucose permease）：

促进葡萄糖进入红细胞，该酶的12个跨膜片段形成一个能跨越膜脂核心的亲水通道。对D-葡萄糖专一（Kt=1.5mM） 红细胞膜的氯-碳酸根交换蛋白

促进Cl— 和HCO3=对称载，不改变跨膜电位。其功能是增加血液携带CO2的能力。

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3．促进转运的动力学分析（类似酶催化动力学） 以葡萄糖促进转运为例：

Sout+T? Sout-T ? Sin -T ? Sin +T V0=Vout [S]out /Kt+[S]out

7．1．3 主动转运（Active transport）

与ATP分解或其他供能机制偶联的逆浓度梯度转运。包括初级主动转运，即与光、氧化、ATP分解直接偶联的转运；和次级主动转运，即和其它物质化学梯度的递降偶联。 1．主动转运的能学

?Gt=RTLn（C2/C1）+Z F??

式中：R是气体常数（8.315J/mol*K），T 是绝对温度，C1和C2分别为转运前后所处位臵的浓度。Z是离子携带的电荷，F是法拉第常数（96480J/V*mol），??是跨膜电位（V）。 2．主动转运建立了离子的跨膜梯度

真核细胞典型跨质膜电位是0.05-0.1V。绝大多数的离子的跨质膜或内膜梯度都维持在10倍以上。 3．“离子泵”

负责离子主动转运的膜蛋白。

Na+-K+-ATPase （Na+-K+-泵）

建立和维持细胞K+和Na+的跨膜梯度的主要责任者，属于整合膜蛋白，由两个跨膜的亚基：50 000和110 000组成，与ATP的分解相偶联，该酶可运出3个Na+，同时运进2个K+。

K+和Na+的跨膜梯度是神经原等电信号发生的基础。由于Na+-K+- ATPase的作用，电荷跨膜分离，细胞内电荷负于细胞外，动物的神经原和大多数非神经原细胞中跨膜电位达到50-70mV。人静息时产能的25%都用于支持Na+-K+- ATPase。

Na+梯度为各类细胞的各种物质协同运输提供动力。例如葡萄糖促进转运可以与钠离子内流协同。

关于Na+-K+-ATPase作用机理的推测。认为ATP水解的产物磷酸基团可以稳定该酶的构像II。酶的磷酸化构像—构像II对K+有高亲和力，对Na+低亲和。而酶的去磷酸化形式—构像I则相反。 4．离子梯度和次级主动转运

由各种离子泵建立起来的跨膜梯度为某些物质的逆浓度转运提供能量，称为次级主动转运。

质子梯度帮助细菌对乳糖的次级主动转运

E.coli借助各种燃料分子氧化的能量将H+运出细胞，建立起质子梯度。借助半乳糖透性酶进行质子和乳糖的对称转运，使乳糖逆浓度梯度进入细胞。

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