微生物学实验 - 第一部分 - 微生物学实验基本技能培训 (4)

1、实验三、四中的注意事项同样适用于本实验。

2、选取活跃生长期菌种、涂片厚度适宜、脱色程度适当，能避免产生假性革兰氏染色结果。 六、实验结果

1、拍摄油镜下观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌或枯草芽孢杆菌与大肠杆菌的单菌涂片及混合涂片的革兰氏染色菌体图。 2、将实验结果填于表3-1。

表3-1 革兰氏染色结果记录表

菌名

七、思考题

1、哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？

2、现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定该菌是革兰氏阳性还是阴性，如何确定你的染色结果的正确性？ 八、讲授重点

1、 细菌革兰氏染色的原理。 2、 革兰氏染色操作要点和结果判断。 九、实验要求

每位同学完成2个单菌涂片及1个三区涂片，进行染色、观察、拍照。记录革兰氏染色结果。提交3张在油镜下观察到的细菌形态图，标明菌种名称和总放大倍数。 十、考核点

1、无菌操作是否规范 2、染色过程操作是否规范 3、显微镜操作是否熟练

菌体颜色

细菌形态

结果（G+、G-）

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实验六 细菌芽孢染色法

一、目的要求

1、学习并掌握芽孢染色法的原理和技术，了解芽孢的形态特征。 2、巩固显微镜操作方法。 二、基本原理

芽孢是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常是圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢及芽孢的形状、在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。因芽孢壁厚、透性低、不易着色，但一旦着色也很难脱去。当用着色力强的染色剂（如孔雀绿、石炭酸复红）在加热条件下染色时，染料可进入菌体和芽孢内，但菌体内的染料经水洗可脱掉，芽孢内的染料依然存在呈色。用对比度大的复染剂染色时，芽孢保留初染剂的颜色，菌体和芽孢囊呈现复染剂的颜色。 三、实验器材

1、 菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）48h斜面培养物。 2、 染色剂：石炭酸复红染液，5%孔雀绿水溶液。

3、仪器或其他用具：显微镜，酒精灯，载玻片，镊子、接种环、载玻片夹子、滤纸等。 四、实验步骤

Schaeffer-Fulton氏染色法： 1、制片：涂片、干燥、固定。

2、染色：5%孔雀绿滴在涂片上，夹子夹住玻片一端，在微火上加热至染料冒蒸气开始计时5分钟。

3、水洗：待玻片冷却后用流水冲洗至流出的水为无色。 4、复染：番红染液复染2分钟，水洗，干燥。 5、镜检 五、注意事项

1、实验三、四的注意事项适用于本实验。

2、选取适当菌龄的菌种进行芽孢染色，幼龄菌尚未产生芽孢，老龄菌芽孢囊已破裂，不易获得正确染色结果。

3、加热时间和温度要适宜，否则芽胞不易着色或温度过高导致菌体或芽孢囊破裂。 4、在将孔雀石绿染液加热时切不可蒸干。

5、脱色时必须等玻璃片冷却后再进行，否则冷水冲洗易导致玻片破裂。

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6、注意安全，谨防烫伤和使用酒精灯时可能引发的火灾。 六、实验结果

观察、拍摄并说明枯草芽孢杆菌的形态特征。 七、思考题

为什么芽孢染色需要进行加热？能否用简单染色法观察到细菌芽孢？ 八、讲授重点

1、芽孢染色原理和Schaeffer-Fulton氏染色方法。 2、细菌芽孢的形态。 九、实验要求

每位同学完成1个芽孢染色标本片，进行观察、拍照。记录染色结果。提交1张在油镜下观察到的细菌形态图，标明菌种名称和总放大倍数。

十、考核点

1、染色结果是否正确 2、涂片质量

3、显微镜操作是否熟练

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第四次实验（4学时，1人/组）

微生物个体形态和群体形态观察（P69-76）

实验七 放线菌个体形态和菌落形态观察

一、目的要求

1、学习并掌握放线菌几种制片方法和简单染色的基本技术。

2、掌握放线菌个体细胞和菌落的形态特征，并注意与霉菌、酵母菌的相互区别。 二、基本原理

放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌，常见放线菌大多能形成菌丝体。紧贴培养基表面或深入培养基生长的叫营养菌丝（基内菌丝，较透明较细），其生长到一定阶段能向空气中生长，叫气生菌丝（较粗，色较暗），由气生菌丝分化形成孢子丝及孢子。孢子丝成螺旋形、波浪形或分枝状等，孢子常呈圆形、椭圆形或杆形。气生菌丝、孢子丝和孢子的形态、颜色常作为放线菌分类的重要依据。制片时通常采用插片法并结合简单染色进行观察，也可以用印片法将放线菌菌落或菌苔表面的孢子丝印在载玻片上，经简单染色后观察。

放线菌菌落干燥、不透明、表面呈致密的丝绒状，上有一薄层“干粉”。 酵母菌是一类呈单细胞生长的真核微生物的总称，少数能形成假菌丝。酵母菌的菌落较湿润，与细菌菌落较相似，但不透明。 三、实验器材

1、菌种：链霉菌（Streptomyces sp.)插片平板培养物。 2、染色剂：吕氏碱性美蓝染液，石炭酸复红染色液。

3、仪器和其他用品：显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、滤纸片、接种环、接种铲、镊子等。 四、实验步骤 （一）插片染色法

1、取盖片：取出放线链霉菌插片平板培养物，用镊子轻取盖片，擦去背面培养物。 2、固定：用酒精灯微热固定。

3、染色：用碱性美蓝染液或石炭酸复红染色液染色 1-2分钟。 4、水洗、干燥

5、观察：菌面朝上置于载片上，镜检观察。

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（二）菌落形态观察

对放线菌琼脂平板上的菌落进行仔细观察，记录菌落大小、形状、透明程度、颜色、表面干燥或湿润，能否易挑取等特征。 五、注意事项

1、放线菌插片法操作过程中，在移动附着有菌体的盖玻片时勿碰动菌丝体，菌面需朝上，以免破坏菌丝体的形态。

2、插片法观察个体形态时，宜用微调节器分别聚焦，以便清晰观察到处于不同焦平面上的孢子、孢子丝、气生菌丝和基内菌丝。

3、观察菌落时，注意正反两面的颜色和菌落表面的薄层“干粉”，仔细分辨与霉菌菌落的异同点。不要随意移动开盖，以免孢子飞散污染实验室。 六、实验结果

绘图并说明所观察到的放线菌的形态特征。 七、思考题

镜检时如何区分基内菌丝、气生菌丝和孢子丝？ 八、讲授重点

1、放线菌个体和菌落的一般形态特征。

2、插片法观察放线菌个体形态的方法和操作要点。 九、实验要求

每位学生利用插片染色法观察、拍照。提交1张在高倍镜下观察到的放线菌形态图，标明菌种名称和总放大倍数。 描述菌落特征。 十、考核点

能否区分放线菌的基内菌丝、气生菌丝、孢子丝和孢子。

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