微生物学实验 - 第一部分 - 微生物学实验基本技能培训 (2)

2、高压蒸汽灭菌开始前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降至0时才能打开排气阀，开盖取物？ 七、讲授重点

1、培养基种类、配制培养基的基本原理与方法。 2、高压蒸汽灭菌和干热灭菌的原理和规范操作流程。 八、实验要求

每组需完成制作棉塞、配制培养基、准备无菌器材 九、考核点

操作是否规范、迅速

6

第二次实验（4学时，1人/组）

实验二 微生物的分离、接种及环境微生物的检测

一、目的要求

1、体会无菌操作技术在微生物研究中的重要性。 2、证实环境中存在微生物。 3、掌握倒平板的方法。 4、学习微生物接种的基本技术。 5、学习分离微生物的常用方法。 二、基本原理

高温对微生物具有致死效应，在微生物接种时，一般在酒精灯旁进行，用火焰直接灼烧接种环，以达到灭菌的目的。

自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法常用的有：稀释涂布平板法、稀释混合平板法与平板划线法。不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各自特有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一。 三、实验器材

1、菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌（Saphylococcus aureus）斜面培养物。 2、培养基

牛肉膏蛋白胨固体和液体培养基。 3、仪器和其他用具

接种环、酒精灯、试管架、记号笔、培养皿、恒温培养箱等。 四、实验步骤 1、微生物接种技术

（1）试管斜面接种法（用接种环转接菌种）：

标记：用记号笔对待接试管斜面培养基进行标记，写上待接菌种名称、接种日期、组别。 取菌：左手拿大肠杆菌试管斜面培养物，右手持接种环，将接种环在火焰上进行灼烧灭菌，然后在火焰旁用右手小指指和无名指或右手掌缘拔出并夹住试管棉塞，试管口在火焰上烧一

7

下。接种环轻轻插入斜面上半部，在管壁冷却水上或管壁上使接种环冷后，挑起少许菌苔，再烧一下试管口，塞上棉塞，左手把斜面试管放回试管架。右手持有菌接种环在酒精灯旁无菌区。

接种：左手从试管架上取出标记好的斜面试管一支，右手掌缘拔出棉塞，试管口在酒精灯上灼烧一下，沾有菌苔的接种环迅速放进斜面底部，从下到上划一直线，然后再从底部开始向上作蛇形划线接种。完毕后，烧一下试管口，塞上棉塞，接种环在火焰上灼烧后放回原处。 培养：试管放37℃培养箱中培养24-36小时。 （2）液体培养基接种法：

接种流程同（1）。接种时略有不同，即将挑有菌苔的接种环在液体表面的管内壁上轻轻摩擦，使菌体分散从环上脱开，进入液体培养基中。轻轻摇匀培养液。 2、平板分离技术 （1）稀释涂布平板法：

倒平板：灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基冷却到55℃左右，摇匀。解开麻绳，去掉三角瓶口上的牛皮纸和纱布，右手持装培养基的三角瓶在酒灯旁，瓶口对着火焰。左手持9cm无菌培养皿并将皿盖在火焰旁打开一条缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，平置于桌面上，使培养基均匀分布于皿底，待冷凝后即为平板。

菌液稀释：取4支无菌试管，每管加9 ml无菌水，无菌操作取1ml大肠杆菌菌液至9ml无菌水中混匀，依次进行10倍稀释。

涂布：取0.1ml稀释菌液入平板中，用无菌涂布棒在培养基表面涂布均匀。 培养：合上皿盖，倒置培养皿于37℃培养24-36小时。

挑菌落：挑取单个菌落的菌苔少许，涂在载玻片上进行显微镜个体形态观察，结合菌落形态特征综合分析。若不纯，需再用平板分离法进行纯化。 （2）平板划线法：

倒平板、培养和挑单菌落同A。

划线：左手拿平板，右手拿接种环在火焰上灭菌后沾取菌液或菌苔一环，在平板上划平行线三条，接种环在火焰上灭菌，左手转动平皿约70度，用无菌接种环通过第一次划线的末端作为起点作二次划线，依次作第三次、第四次划线（平行线划线法）。或将挑取有菌的接种环在平板培养基上作连续划线。 3、环境微生物的检验

将1个牛肉膏蛋白胨平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培养基暴露在

8

空气中，将另一牛肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动的其他实验室，移去皿盖。10min后盖上两个皿盖。 五、注意事项 1、无菌技术

手和台面要消毒；

无菌操作需在火焰旁进行，手不可触摸试管口端，以防烫伤； 接种时接种环不要碰触试管口边，防止污染；

棉塞不可放在桌面上，应该用右手手缘或右手指间夹住。 2、平板分离技术

倒平板时，培养皿边缘不要沾染培养基，摇匀培养基时要轻，以防培养液溅到皿盖或溢出培养皿；

划线接种时，动作要轻，注意不要划破培养基； 分离、接种时应严格按无菌操作要求进行； 平板培养微生物时要倒置培养。 六、实验结果

1、记录液体培养基和固体斜面培养基上，细菌的生长状况。 2、记录菌种分离培养的结果。 七、思考题

1、平板培养时为什么要把培养皿倒置？

2、在划线分离时，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉？ 八、讲授重点 1、倒平板 2、微生物转接方法 3、平板划线法和涂布平板法 九、实验要求

每位学生练习倒平板、液体试管接种、斜面接种、平板划线和涂布平板。 十、考核点

1、无菌操作是否规范 2、平板划线方法是否正确

9

实验三 显微镜的基本知识及使用方法

附：数码显微镜的使用

一、目的要求

1、掌握普通光学显微镜的构造及各部分的功能。

2、学习并掌握油镜的原理、使用方法、维护的基本知识。 3、掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能。 4、学习显微数码系统的使用方法。 5、了解微生物在显微镜下的基本形态特征。 二、基本原理

现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成，在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率，而在普通光学显微镜通常配制的几种物镜中，油镜的放大倍数最高，但需要在载波片与镜头之间加滴镜油，主要是为了增加照明亮度和提高显微镜的分辨率。

物镜放大倍数越大，焦距越短，直径更小，所需光强越大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同，会发生折射或全反射使光线不能进入镜头。结果导致物像不清。在油镜和玻片间滴加与玻璃折射率（空气是1.55，香柏油是1.52）相近的镜油，使光线不会造成太大的损失。

显微镜分辩率是显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力，最小距离越小，分辨率越高。分辩率=λ/2NA=λ/2n·sin（α/2） 公式中λ可见光波长，平均为0.55μm，n折射率(香柏油1.52，空气1.0，水1.33)，NA是物镜的数值孔径，取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率。 三、实验器材

1、标本片：霉菌标本片、细菌（枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis等）的标本片（2片/组）。 2、溶液和试剂：香柏油、乙醇乙醚混合液或二甲苯等（各一瓶/组）。 3、仪器或其他用具：普通光学显微镜（1台/组）、擦镜纸。

四、实验步骤 （一）显微镜操作

10

搜索“diyifanwen.net”或“第一范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，第一范文网，提供最新初中教育微生物学实验 - 第一部分 - 微生物学实验基本技能培训 (2)全文阅读和word下载服务。