微生物学实验 - 第一部分 - 微生物学实验基本技能培训 (7)

第六次实验（4学时，1人/组）

微生物的大小和数量测定

实验十 微生物大小的测定

一、目的要求

1、学习并掌握使用显微测微尺测定微生物的大小的方法。

2、掌握对不同形态细菌细胞大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细胞大小的感性认识。 二、基本原理

1、 微生物的大小是微生物重要的形态特征之一，分类鉴定的依据； 2、 目镜测微尺和镜台测微尺是测量工具。

微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。

镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成像进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 三、实验器材

1、活材料：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)斜面菌种(菌悬液) 2、溶液和试剂 香柏油， 乙醇乙醚

3、仪器和其他用品：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、滴管、擦镜纸。

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四、实验步骤

1、目镜测微尺的安装和校正

把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。

例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0μm，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm

用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。

由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 2、微生物大小的测定

(1)将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液（10） (2)取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。

(3)移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10—20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。

（4）同法用油镜测定微生物染色标本的长和宽。 五、注意事项

1、目镜测微尺很轻、很薄，在取放时应特别防止使其跌落而损坏； 2、观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度； 3、小心进行镜头的转换，防止接物镜压坏测微尺和损坏镜头； 4、目镜测微尺的安装方向；

5、显微镜下镜台测微尺的刻度线较粗，注意判断两线重叠时采用的标准要一致。

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六、实验记录与结果

将实验结果填入下列表格

表6-1 目镜测微目尺校正结果

物镜 目镜测微尺格数 镜台测微尺格数 目镜测微尺每格代表的长度/（μm） 10× 40× 100× 目镜放大倍数：

表6-2酵母菌大小测定记录

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 平均值 宽度 长度

酵母菌大小：宽μm×长μm＝

结果计算 长μm＝平均格数×校正值

宽μm＝平均格数×校正值

大小表示：宽μm×长μm 七、思考题

1、为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？

2、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果时候相同？ 八、讲授重点

1、微生物大小是分类鉴定的依据；

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2、目镜测微尺和镜台测微尺的工作原理； 3、目镜测微尺和镜台测微尺的安装。

九、考核点

目镜测微尺和镜台测微尺的安装和校正

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实验十一 微生物数量的测定

一、目的要求

1、学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法； 2、了解光电比浊法的原理；

3、学习、掌握光电比浊法的操作方法。 二、基本原理

测定微生物细胞数量的方法很多，显微直接计数法和光电比浊法是较常用的两种方法。 1、显微计数法的使用：显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血细胞计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。

2、血细胞计数板的构造和使用原理：血细胞计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。

计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm，每个小方格的面积为1/400mm。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm，每个小方格的体积为1/4000mm。

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