质粒DNA的提取、纯化与鉴定 - 图文 (2)

山东大学实验报告

姓名 宿智新 学院 生命科学学院 班级 11级生工2班 科目 分子生物学实验 学号 201100140155 第 8 组

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DNA纯度检测 取40mLTAE（1×）于300mL锥形瓶中，加入0.4g制胶时，胶液温度过高，琼脂糖，放入微波炉内使其熔化，60℃时倒入会使模具变性，影响胶孔准备好的制胶槽中。 大小和胶形状，从而间接影响加样量和跑条带。胶液温度过低，会凝固，所以在胶液冷却至50~60℃左右倒胶。 取5.0μl纯化DNA加入1.0μl上样缓冲液，注意加样时枪尖应恰好混合，进行点样。 置于液面下凝胶点样孔上方，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。 点样完毕后，100V，200mA条件下电泳30min。 电泳完毕后，进行EB染色，用凝胶成像仪拍溴化乙锭是一种强致突照，得到实验结果。 变剂，应严格戴手套操作！ 注意事项

1) 扩大培养菌体时，挑了单菌落的接种环要在三角瓶的液避接面处研辗，瞬间

可看到菌体进入培养液造成的局部浑浊。 2) 沉淀菌体的量不要贪多，适宜即可，菌体过多，可能会导致溶液Ⅰ无法混匀，

细胞裂解不充分。

3) 加入溶液Ⅰ重悬要充分，如果细胞没有完全散开悬浮，将会影响溶液Ⅱ裂解

细胞，最终导致提取产物中含较多的蛋白质，染色体DNA等杂质。

4) 加入溶液Ⅱ时摇匀一定要轻柔，剧烈会导致基因组DNA断裂；静置时间也不

能过长，因为基因组DNA在碱性条件下会慢慢断裂。

5) 使用离心机时，样品放置要对称平衡，否则会严重损害离心机的使用寿命。 6) 制胶时，胶液温度过高，会使模具变性，影响胶孔大小和胶形状，从而间接

影响加样量和跑条带。胶液温度过低，会凝固，所以在胶液冷却至50~60℃左右倒胶。

7) 注意加样时枪尖应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品

溢出孔外。跑多个样时，应依次快速点样，否则时间一久，样品会弥散掉！ 8) DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，点样

孔在负极。注意使电泳槽中缓冲液没过琼脂糖凝胶2mm为宜。 9) EB是一种强致突变剂，应严格戴手套操作！

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实验结果

凝胶电泳拍照结果

Ⅳ Ⅰ Ⅱ Ⅲ 图质粒DNA纯度检测凝胶成像结果 标注：

1号泳道：λDNA marker /HindⅢ 2号泳道：线性的pUC19质粒DNA

3号泳道：超螺旋状态的pUC19质粒DNA 4至15泳道：1至12组的pUC19质粒DNA

16泳道：加葡萄糖培养的线性的pUC19质粒DNA 17泳道：隔夜菌株培养的线性的pUC19质粒DNA 18号泳道：未加RNase A的线性的pUC19质粒DNA Ⅰ 以上带是λDNA出现处

Ⅱ 以上带是线性的pUC19质粒DNA出现处 Ⅲ 处是RNA出现处

Ⅳ 处是点样槽，其中的光斑则是代表蛋白质

各带光斑由上向下分别代表的分子量由大到小，各光斑的亮度则表示该物质含量的高 低，越亮则代表浓度越高

分析

理论上碱变法提取质粒DNA琼脂糖凝胶电泳可能出现条带情况如下（按离点样孔远近排序,即电泳速度快慢排序）：

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1. RNA：没有完全裂解除去的RNA浅条带；观察Ⅲ处各组均有RNA残留,但是俩

都不是很多。 2. cccDNA：共价闭合环状质粒DNA,即所要提取的pUC19质粒超螺旋结构；观察

Ⅱ区域各组条带亮度相差不多,因此产量相近,只有9号条带几乎观察不到,对于九号后面会有专门的分析。各组也均有拖带的现象,但都不是很明显。

对于我们组8号,个人还是比较满意,毕竟第一次做,个人观察产量估计是 180ng/ml。

3. ocDNA:质粒的一条链断裂，超螺旋松弛开环结构。

4. L DNA:DNA 复制中间体，即没有复制完全的两个质粒连在了一起。经典的实

验教材一般认为这条带是线性结构质粒，实际上, 这是一种误解。正常情况下, 碱法提取的质粒很少有线性的, 电泳一般不出现。经验也提示, 只有一个酶切位点的内切酶切割质粒时, 结果总是只有一条电泳条带。如果有线性结构质粒, 则不可能出现这种结果。因为如果有线性质粒的话, 单一酶切不可能出现单一条带。

5. 染色体DNA:如果在加入溶液Ⅱ后过渡振荡，会产生这条带，该带泳动得较慢，

是20—100Kb的大肠杆菌基因组DNA片段,即Ⅰ线上方区域,观察各组条带均有白色暗斑,相对来说我感觉我们组的8号带还是比较好的,而5、7、16号就比较明显了。

6. 如在点样孔附近出现荧光，则说明提取的质粒DNA中含有较多的蛋白质，阻

碍了部分DNA泳动，形成荧光。观察各组的点样孔Ⅳ ，5、7、11、12、14、16号带白色较明显,很可能是蛋白质去除不彻底 ,也可能是点样时戳破了点样孔。

我组是8号,相对来说比较好,蛋白质去除比较干净。 7. 第九组没有提取出pUC19的可能性分析：

(1)有的组得出了很好的结果，作为对照，排出了菌体或实验方法本身等源头出现问题，只能是自己实验操作出了问题；

(2)电泳图谱显示出了RNA浅条带，又RNA一直和质粒DNA处于同一相，所以不可能是将提取的质粒误丢；

(3)两次电泳结果都一样，排除点样跑胶问题；

(4)整个提取质粒过程应该没有问题。因为，从实际现象上看，得到的DNA粗沉淀为乳白色，其颜色和量都正常。从理论上分析，即使是加溶液Ⅰ没有充分悬浮，或者是加溶液Ⅱ和Ⅲ时震荡过于激烈，那产物中也应该会有质粒DNA，只是带有较多蛋白质，染色体DNA等杂质； (5)最大的可能性是最后一步加1/10V 3mol/L NaAc（pH5.2）和2V冰乙醇沉淀纯化后的DNA出了问题，因为上清液不是按既定量程一次性吸取出来的，当时操作人也不清楚第二次吸取的上清体积，所以就大约估计为350ul。可能是体积估计误差较大，所以加入NaAc和冰乙醇后，Na+和乙醇浓度都没有达到沉淀DNA的标准，DNA没有被沉淀！

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讨论

1. 酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。皮肤如不小心沾到

酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。

2. 本次实验中，原应灭菌之前加入培养基内的葡萄糖由于操作疏忽而忘记

加入，随后按照老师指示配制100mL 10%的葡萄糖溶液一起灭菌，待灭菌后再将葡萄糖溶液加入培养基中。

3. 为最大限度去除上清，可在倒掉部分上清后，再将离心管放入离心机稍

作离心，使残留在管壁的液体集中到离心管底部，再用移液器移除液体。 4. 为获得高纯度的质粒DNA，必须彻底去除杂蛋白、染色体DNA和RNA。在

整个质粒提取过程中出去染色体DNA的关键步骤是加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的变性和复性环节，应控制好变性和复性的时机。加入溶液Ⅰ时，可剧烈震荡，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂；加入溶液Ⅱ时，菌液变粘稠、透明，无菌块残留；加入溶液Ⅲ时，会立即出现白色沉淀。加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后，应缓慢上下颠倒离心管数次，切忌在旋涡振荡器上剧烈振荡，否则染色体DNA会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利于质粒DNA提纯。因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的方法，既要使试剂与染色体DNA充分作用，又不破坏染色体的结构。 5. 在纯化DNA加入冰乙醇的步骤中，2只离心管在加入的DNA样品量相同的

情况下，出现了从-20℃环境下取出后2只离心管内液体体积相差较多的情况，分析后发现量较少的1只离心管内加入的各种试剂的量是合适的。可能的原因：①在用移液器移取冰乙醇时下按力度太大，吸入过多液体；②2只离心管分别由2名组员加液，操作上可能出现个人之间的误差。 6. 本次实验得到的质粒DNA较少，最主要原因是选择了菌体生长较少的培

养基，仅得到较少的粗提物，导致最终纯化得到的质粒DNA也较少。 附注：

培养基及实验试剂配方： 1. LB（Luria Broth）培养基

LB液体培养基：1%蛋白胨（typtone），0.5%酵母粉（yeast extract），1%NaCl。用NaOH调pH至7.2, 121℃灭菌20min备用。

LB固体培养基：除以上LB培养基成分外，还需要添加1.5%~2%琼脂，121℃灭菌20min备用。

LB半固体培养基：在LB液体培养基中加入0.75%琼脂，121℃灭菌20min备用。

2. 氨苄青霉素：母液浓度为100μg/μl，工作浓度为50~100μg/mL。 3. TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA。

4. 氯仿/异戊醇混合液：按氯仿：异戊醇为24：1（V/V）的比例在氯仿中加

入异戊醇。

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5. 酚/氯仿/异戊醇（PCI）混合液：

饱和酚：分析纯的酚溶化后经160℃重蒸后，加入0.1%（V/V）的抗氧化8-羟基喹啉，再加入等体积的0.1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液反复抽提，使之饱和，并使其pH为8.0，亦可购买商品化的饱和酚。

按酚与氯仿/异戊醇为1：1的比例混合饱和酚与氯仿/异戊醇混合液，即得酚/氯仿/异戊醇（PCI）（25:24:1）混合液。 6. 6×上样缓冲液：30%甘油，0.25%溴酚蓝（bromophenol blue, BPB），0.25%

二甲苯氰FF。

7. 溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10mmol/L

EDTA。

8. 溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH，1%SDS(临用前用10mol/L NaOH和20%SDS

母液配制)。

9. 溶液Ⅲ：5mol/L KAc 60mL，冰醋酸11.5mL，重蒸水28.5mL；溶液

终浓度为：K+ 3mol/L，Ac- 5mol/L；

10. RNase A 母液：将RNase A溶于含10mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)和

15mmol/L NaCl的溶液中，配成10mg/mL溶液，于100℃加热15min，使污染的DNase失活。冷却后用1.5mL无菌离心管分装，保存于-20℃。

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