DNA甲基化检测方法研究进展(2)

２００７年第１１期

由于第二对限制酶识别序列非常罕见，所以一般都用Ｈ户口ＩＩ—ＭｓｐＩ（ＣＣＧＧ）。两个酶都识别ＣＣＧＧ序列，而当其中的胞嘧啶甲基化时，ＨｐａⅡ不能够将

啶的氨基，在此反应中除ｍＳＣ外其余胞嘧啶均可被转变为尿嘧啶。然后将这些靶序列用特异引物扩增，经过扩增的ＤＮＡ，所有尿嘧啶均转化为可检测的胸腺嘧啶，只有ｍ５Ｃ以胞嘧啶形式被扩增。这种方法是目前所使用的在给定基因组靶序列中分析ｍ５Ｃ最常用的方法。可以检测到每个ＣｐＧ位点的甲基化情况。基于此原理，发展出亚硫酸氢盐去氨基反应后，结合ＰＣＲ扩增的快速方法来检测ｍ５Ｃ，称为甲基化特异ＰＣＲ（ＭＳＰ），这种ＭＳＰ方法运用特别设计的针对甲基化的和非甲基化序列的引物，从而得到特异扩增的甲基化或非甲基化靶序列。目前已经被广泛应用到ＣｐＧ岛甲基化检测。此方法适用范围很广，可以检测包括已知的、接近ＰＣＲ引物的及限制性酶切范围的ＣｐＧ双核苷酸序列的甲基化状况［１

０’。

其切开，这就使得Ｈ加Ⅱ一ＭｓｐＩ能够作为快速甲

基化分析的工具。但是这个方法有些不足：首先，并不是所有的ＣＧ都位于ＣＣＧＧ序列内，意味着一些可能的甲基化位点没有被检测到；另外一个问题是必须用复杂的ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ杂交。这种方法还要求有高分子量ＤＮＡ及有较多甲基化的等位基因，而且仅能检测到限制性内切酶能够识别的ＣｐＧ序列［６］。尽管如此，甲基化敏感限制酶法仍然是甲基化分析的首选方法。

１．２

限制性酶及ＰＣＲ的方法

Ｈｅｒｍａｎ等［７］１９９６年在使用重亚硫酸盐处理的

基础上新建的一种方法。即用限制性内切酶（对甲基化不敏感与敏感的同裂酶）切割后，再用含有酶切位点序列的引物进行ＰＣＲ扩增。检测甲基化敏感酶的ＰＣＲ扩增产物，如果用针对处理后甲基化ＤＮＡ链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；若用针对处理后的非甲基化ＤＮＡ链的引物扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化。这种方法虽然可以提高ＤＮＡ量少时检测的敏感性，但它同样存在不足，比如在限制性酶消化不完全情况下会出现假阳性结果。１．３直接测序法

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