DNA甲基化检测方法研究进展(3)

直接测序法之一是基因组直接测序法。基因组ＤＮＡ经Ｍａｘａｍ－－Ｇｉｌｂｅｒｔ化学裂解法进行处理，并以连接接头介导的ＰＣＲ（１ｉｎｋｅｒ

ｍｅｄｉａｔｅｄＰＣＲ，ＬＭ

１．５其他甲基化分析方法

前面４种方法以及络合物介导ＰＣＲ／肼反应／高锰酸盐反应、原位ＭＳＰ杂交法、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸法（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ—ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ

ｓｉｎｇｌｅ

ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，Ｍｓ—ＳｎｕＰＥ）、结合重

亚硫酸盐的限制性内切酶法（ｃｏｍｂｉｎｅｄｂｉｓｕｌｆｉｔｅ

ｓｔｒｉｃｔｉｏｎ

ｒｅ－

ａｎａｌｙｓｉｓ，ＣＯＢＲＡ）以及甲基化敏感性单链

构象分析法（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｓｉｎｇｌｅ—ｓｔｒａｎｄ

ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ，ＭＳ—ＳＳＣＡ）等主要应用于

单基因序列特异性甲基化分析和特异性位点ＤＮＡ甲基化分析；目前应用于全基因组序列特异性甲基化分析的方法有：甲基化差异性杂交显示（ｄｉｆｆｅｒｅｎ—

ｔｉｍｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＤＭＨ）、寡核苷酸微

－－ＰＣＲ）对信号强度进行放大，可以增加甲基化检测的敏感性，这是过去一直沿用的研究ＤＮＡ甲基化方法。这种方法的缺点是技术要求较高，而且容易出现假阳性及假阴性。另外一种是由Ｆｒｏｍｍｅｒ等提出的研究ＤＮＡ甲基化方法Ｅ８１。其过程是：重亚硫酸盐使ＤＮＡ中未发生甲基化的胞嘧啶（Ｃ）脱氨基转变成尿嘧啶（Ｕ），而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行ＰＣＲ扩增所需片段后，尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶（Ｔ），最后对ＰＣＲ产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断ＣｐＧ位点是否发生甲基化。这种方法的可靠性及精确度都很高，能检测到目的片段中每一个ＣｐＧ位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐，费用也比较高［口］。

１．４

阵列法、基因组限制性酶切扫描法（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｌａｎｄ－

ｍａｒｋｇｅｎｏｍｅｓｃａｎｎｉｎｇ，ＲＬＧＳ）［‘Ｊ、ＭＢＤ（ｍｅｔｈｙｌ－－ＣｐＧｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｃｏｌｕｍｎ

ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，甲基

化结合区）柱层析法［１１１、联合甲基化敏感性限制性内切酶的ＭＢＤ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ

ｏｆｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ—ＤＮＡ

ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎａｎｄｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ

ｅｎｚｙｍｅｓ，ＣＯＭＰＡＲＥ－－ＭＳ）Ｃ１２１。

研究甲基化的方法之多，一方面说明了甲基化研究难度大，另一个方面也说明这些方法都存在着一定的限制。面对具体问题，选择最合适的解决方法就显得尤为重要。首先，根据研究目的选择合适方法。应该明确是研究整体水平的甲基化还是特定位点的甲基化，或是要发现全基因组中新的甲基化位点；其次，根据客观条件筛选方法，如：目标序列是否已知，是定量研究还是定性研究，样本来源及数量如何，是否需要高通量的样本检测方法Ｉ最后，全面

甲基化特异性ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ亚硫酸氢盐可以氧化去除基因组ＤＮＡ中胞嘧

ＰＣＲ，ＭＳＰ）

１８．

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