植物体细胞杂交及其杂种鉴定方法研究进展(3)

亲和的种间或属间的体细胞杂交创造了有

利条件，增加了获得可育再生植株的可能性[。目 4 2]前也有用紫外线辐射处理，并得到了较好的非对称

展，基因转化系被应用于体细胞杂交。Sm y v1 a ol[ o5]在进行番茄与茄子不对称体细胞杂交时，供体为卡那霉素转化系，但辐照使之钝化，不能分裂，而受体对卡那霉素敏感，只有具受体全套基因组和供体抗卡那霉素基因杂种才能在含卡那霉素的培养基上生长。我国夏光敏[,则利用融合产物的再生能力 55 2」 3互补法来选择杂种。即受体和供体愈伤组织都经过多年的继代，或供体经高剂量辐照后失去再生完整植株的能力，但融合产物具有再生完整植株的能力，从而获得杂种植株。近几年，一些学者[,通过化 55 45〕学试剂如 I A, a ie O R dm n 6G等钝化受体原生质 o -

杂交效果。Pau k 4建议用超致死剂量辐照 hdi等[ v 3]供体细胞或原生质体，使其染色体被击成“小片段”,然后与一个正常受体细胞或原生质体融合。在部分同源的适宜条件下发生重组，使供体染色体碎片“掺人”受体染色体中，从而形成具有受体整套染色体组，而仅有少量供体染色体片段的不对称杂种。辐照剂量因物种不同差异很大， X射线和“ o o Y C一射线

一般在10 00。如Bt等仁用10辐 0-1 G 0 y as“ 0G e〕 y照蓝茉莉叶烟草原生质体与普通烟草原生质体融合

植物体细胞杂交及其杂种鉴定方法研究进展

1期

张改娜，:等植物体细胞杂交及其杂种鉴定方法研究进展

体，使其线粒体失活，而用物理辐照钝化供体原生质体使其核染色质受到伤害从而也失去持续分裂的能力，但融合后的杂种细胞由于生理互补可形成愈伤组织及植株，从而可以被筛选出来。这种筛选体系简单省时，获得的杂种植株由于都是亲本基因，不存在不安全因素，易于推广使用。

C cm s。白化突变体在 P R产物中只有 1 uu im l e C个酶切位点，从而获得 31和 33 2 8b y 1 b个片段， y亲本 C m r cru的这段序列则有 2 S u . i ap s yo个 a3 A酶切位点，其中一个位点将 31 8b y的片段又分为 24 2 b和 17。这样拟在杂种中， y 5b y只要同时存在这 5

个段，可以定杂 L等’。[片就确为种。 i .和F等s u〕 o]也通过此法鉴定并确定了属间体细胞杂种。随机扩增多态性 D A技术( A D即一段与 N RP)某一单一引物

(一般为 1 0聚体引物)同源的 D A N序列，有可能在 D A模板的不同位置出现， N这些位置之间的距离又处于可通过 P R进行扩增的长度 C范围，因此，当条件满足时，单个寡核昔酸引物就可

5体细胞杂种的鉴定杂种细胞的筛选仅提供了细胞杂种真实性的间 接证据。由于初始融合产物的遗传物质可能被排除，或在培养过程中会发生体细胞克隆变异等现象，因而还必须对获得的杂种进行严格的鉴定。用来鉴定体细胞杂种的方法除形态学(花的颜色、形态、叶子的形态和大小等)比较，细胞学观察(染色体、叶绿体数目、形态等)和生化分析(同工酶和次生代谢产物等)最直接的杂种证据来自于分子生物学鉴外，定。目前，用于体细胞杂种鉴定的分子生物学方法

以在 P R反应中介导 D A呈几何级数扩增。实 C N际操作中，每个 1聚体寡核昔酸引物， 0通常可产生几个(.1) ( 0不连续的 D A产物。这些产物是由 3 N不同的遗传位点产生的。多态性的产生是由突变或重排造成的。R P通常作为显性标记，然 AD虽 R P A D不能鉴定杂合子，重复性较差，但是用 R P AD检测容易、非专业人员也能操作、又易于实现自动化，所以在体细胞杂种鉴定应用中较广泛。徐子勤

有 R L,A D Suhr杂交、 F P R P,ote n原位杂交等。 51 F P和 R P . L R A D应用于鉴定体细胞杂种D A的限制性片段长度多态性 ( F P是由 N RL)于核酸序列不同而造成 D A限制性片段之间产生 N等位基因差异的结果，具有种的特异性和遗传稳定

等[〕 R P 1应用 A D分析紫花首猎与红豆草属间体细 9胞杂种，发现杂种细胞从双亲获得的遗传信息不等，杂种细胞的核遗传信息较多的来自于首借。金红等，〕‘应用 R P A D进行杂种鉴定的研究中也有类似的发现。

性，是一种非常丰富的遗传标记。它能直接发现同

源染色体上核昔酸碱基序列的差异， R L且 F P数量多，受环境和遗传背景影响小，在发育过程中稳定，通常以简单的孟德尔式遗传。等位基因常是共显性的，是检测个体间、品种间、种间 D A水平上的等 N

52种特异重复 D A . N

位性变异最敏感的方法。目前已构建的 R L F P遗传图谱的基因较少，主要有番茄[,、[ 5玉米[、 55 4] 5马铃 5]

重复 D A的进化速度很快， N而且在不同植物间存在着高度的序列变异，用种特异的重复 D A

N序列作探针对酶解的基因组 D A进行 S uhr N o ten杂交是一种确定体细胞杂合体的核杂种性可靠的方法。压片印迹和斑点印迹都是用种特异序列来确定体细胞杂种核杂种性的方法，其中斑点印迹可使各个亲本基因组对体细胞杂种相对贡献量化。用种特异性的探针与杂种的染色体涂片进行原位杂交，还可以鉴定出亲本的染色体、染色体片段以及易位。但是这两种方法都必须找到种特异性重复序列，而种特异性重复序列的分离，也较为复杂、费时。所以目前运用较多的是基因组原位杂交技术。 53 ote杂交在体细胞杂交中的运用 . Su r hn

薯[和某些油菜[等， 5 4〕 5所以用 R L 6] F P鉴定的体细胞杂种主要是番茄属(yo in L prc ) c e o和茄属(o - s Sl anm, u )以及芸苔属( rs c) B s a的一些种间和属间体 ai细胞杂种[.。另外， 55 4] 7由于植物基因组 D A较大， N RL F P片段在一块胶板上难以完全分开，所以常利用外源基因作探针， R L将 F P转移到尼龙膜上进行 Su e杂交。如 Wii s 5通过遗传作图， ot r hn l m等[ l a 8]选用连锁群特异的 R L F P标记，区分出了 S ln m oau

bv e与Stes r in ed s . ru u o m的种内杂种的染色体。 b近几年来又发展了P RR L C - F P法，即先采用广谱引物对亲本和杂交种进行 P R, C然后再用限制性内切酶酶切。Bra等[用部分基因组 D A进行 ods 5 9[ N RL F P分析，他们首先利用引物 I S, 4 T 1 I S对亲本 T和拟杂交种的基因组 D A的 1^2 s A进行 N 8 -5 D rN P R扩增， C然后用 S u a 3 A对 P R产物进行酶切， C

Su e b tn探针的标记， ltg ot r o i h n以前多用的是3同位素标记， 2 p由于同位素放射对人体造成伤害，后来发展了荧光标记法和地高辛标记法。杂交所需的探针有 R L F P片段，种特异性重复序列，目前运用较多的是外源标记基因(尤其是不对称杂种中供

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