非律平和制霉菌素对人羊膜上皮细胞鞘脂类代谢的影响(2)

３７℃，５％ＣＯ２培养，

１ｄ后分别加入０．２或１０μｍｏｌ·Ｌ－１非律平［１７］，０．０５４或０．１０８μｍｏｌ·Ｌ－１［１８］

制霉菌素，继续培养３０ｍｉｎ［１８－１９］。

１．３　鞘脂的提取

将４×１０７

个细胞溶于５００μＬ氯仿与甲醇（２∶１，Ｖ／Ｖ）混合液，然后加入１ｍＬ蒸馏水混匀，４７７０×ｇ离心１５ｍｉｎ，吸取下层，放入真空抽干机抽干。抽

干的剩余物加入５

００μＬ含０．１ｍｏｌ·Ｌ－１

ＮａＯＨ的甲醇，放入５

５℃水浴处理１ｈ。然后加入１００μＬ的１ｍｏｌ·Ｌ－１

盐酸、５００μＬ正己烷和５０μＬ蒸馏水，４７７０×

ｇ离心１５ｍｉｎ。分层后，吸取下层液体放入真空抽干机抽干。抽干后的剩余物加入０．８ｍＬ的氯仿、甲醇和水（８６∶１４∶１，Ｖ／Ｖ／Ｖ）的混合液和０．２ｍＬ的氯仿、甲醇和水（３∶４８∶４７，Ｖ／Ｖ／Ｖ）的混合液，４７７０×ｇ离心１５ｍｉｎ，吸取下层，放入真空抽干机抽干，剩余

物即为鞘脂类样品，放入－７０℃储存［１３］。

１．４　ＭＡＬＤＩ?ＴＯＦ质谱分析

样品溶于５μＬ氯仿和甲醇（２∶１，Ｖ／Ｖ）的混合溶液，然后加入５μＬ基质液（包含０．５ｍｏｌ·Ｌ－１

乙酸乙酯和０．１％三氟乙酸）放于０．５ｍＬ的离心管中，将离心管放在漩涡振荡器上混合均匀，再离心１ｍｉｎ

。取１μＬ混合物点在样品靶上热风吹。仪器测定条件如下：Ｎ２激光３３７ｎｍ，加速电压２０ｋＶ，正离子反射／延迟模式，延迟时间１００ｎｓ。应用Ｃ２?二氢神经酰胺（ｄｉｈｙｄｒｏｃｅｒａｍｉｄｅ）（相对分子质量３４３．６）校准。处理组和对照组均重复３次，

每个样品得到６或７张质谱图，只有当一个峰在５张以上的图中出现且它的相对丰度大于３％，才认为它存在并用

·４１７·

于分析。所有质谱图均按照以上方法分析，所得到的差异性质谱数据与本实验室建立的鞘脂类数据

库［

１３］

进行比较。目前我们建立的数据库包含了常见的近９０种标准鞘脂类样品的质谱分析图谱。本研究分析的是神经酰胺和鞘磷脂。神经酰胺的结构是鞘氨醇氨基以酰胺键与一长链脂肪酸羧基相连，鞘磷脂的结构是神经酰胺的极性头部是磷酰胆碱，不同的神经酰胺和鞘磷脂只是碳链数和双键数目以及侧链上的一个羟基的变化，所以利用实验中得到的数据与数据库对比，根据分子量和神经酰胺及鞘磷脂的基本骨架，可以推测出成分的结构。

２　结果

２．１　非律平对ＦＬ细胞鞘脂类代谢的影响

神经酰胺分子在质谱分析中主要出现在质荷比（

ｍ∶ｚ）５００～７５０的范围内；而鞘磷脂分子主要出现在ｍ∶ｚ７５０～９００的范围内。在未经非律平处理的对照ＦＬ细胞中，经质谱分析发现极少有神经酰胺分子的存在，仅有少数几种鞘磷脂分子的存在（表１）。由于研究中经常使用的非律平浓度为０．２和Ｔａｂ１．　Ｅｆｆｅｃｔｏｆｆｉｌｉｐｉｎａｎｄｎｙｓｔａｔｉｎｏｎｓｐｈｉｎｇｏ?ｌｉｐｉｄｓｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｈｕｍａｎａｍｎｉｏｎｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ

ｍ∶ｚＣｏｎｔｒｏＦｉｌｉｐｉｎ／μ

ｍｏｌ·Ｌ－１

Ｎｙｓｔａｔｉｎ／μ

ｍｏｌ·Ｌ－１

０．２１００．０５４０．１０８

５３６＋

＋

５５２＋

５８０＋

＋

６１２＋

＋

６２４＋

＋

６５８＋６６０＋＋＋

＋

６６８＋

＋

６７６＋７２０＋＋＋＋８１２＋＋＋＋＋＋＋８３４＋＋＋＋＋＋＋８３６

＋

＋

＋

＋＋

＋＋

Ｔｈｅｈｕｍａｎａｍｎｉｏｎｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｆｉｌｉｐｉｎａｎｄ

ｎｙｓｔａｔｉｎ

，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｆｏｒ３０ｍｉｎ．Ｌｉｐｉｄｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏｍａｔｒｉｘ?ａｓｓｉｓｔｅｄ，ｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ?ｉｏｎｉｚｉｎｇ?ｔｉｍｅｏｆｆｌｉｇｈｔｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｉｓｉｓｔｈｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｍａｓｓ

ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｄａｔａ．ｍ

∶ｚ：ｍａｓｓｔｏｃｈａｒｇｅｒａｔｉｏ．

目的 研究脂类干扰剂非律平和制霉菌素对人羊膜上皮细胞鞘脂类代谢的影响是否相同。 方法?┯τ没?质辅助激光解吸附飞行时间质谱分析方法分析不同剂量非律平和制霉菌素对人FL细胞株鞘脂类代谢的影响。 结果 非律平和制霉菌素均可影响FL细胞鞘脂类代谢,但是非律平(0.2 和10 μm

·４１８·

１０μｍｏｌ·Ｌ－１［１７］，本研究首先用非律平０．２μｍｏｌ·Ｌ－１处理ＦＬ细胞３０ｍｉｎ后，提取细胞鞘脂类，进行

质谱分析。发现在ｍ∶ｚ５００～７５０的范围内有较大的改变。ｍ∶ｚ５３６，５８０，６２４，６６０，６６８和７２０等出现，表明有新的神经酰胺分子合成（图１）。而在ｍ∶ｚ７５０～９００范围内的几种鞘磷脂分子峰都没有改变，表明非律平对于鞘磷脂分子的代谢影响较小，而对于神经酰胺代谢的影响较大。

　　进一步用非律平１０μｍｏｌ·Ｌ－１

处理，ＦＬ细胞鞘脂类的变化与０．２μｍｏｌ·Ｌ－１处理的结果

一致（表１

），

表明低浓度和高浓度的非律平对于鞘Ｆｉｇ１．　Ｃｈａｎｇｅｓｉｎｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎ?

ｄｕｃｅｄｂｙｆｉｌｉｐｉｎａｎｄｎｙｓｔａｔｉｎ．ＳｅｅＴａｂ１ｆｏｒｃｅｌｌｔｒｅａｔ?

ｍｅｎｔｓ．Ｔｈｉｓｉｓｔｈｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｄａｔａ．

ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ　２００７　Ｏｃｔ；２１（５）

脂类和神经酰胺代谢的作用无明显差别。

利用我们实验室已经建立的质谱数据库［１３］

，搜

索以上差异的质谱峰，可以推断部分分子可能的结构图，如ｍ∶ｚ５８０和７２０的可能结构见表２。Ｔａｂ２．　Ｐｒｏｐｏｓｅｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｆｏｒｓｏｍｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ

搜索“diyifanwen.net”或“第一范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，第一范文网，提供最新实用文档非律平和制霉菌素对人羊膜上皮细胞鞘脂类代谢的影响(2)全文阅读和word下载服务。