酿造酒中氨基甲酸乙酯控制的研究进展及对中国黄酒的借鉴_管政兵

网络出版时间：2012-07-16 12:01

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酿造酒中氨基甲酸乙酯控制的研究进展及对中国黄酒的借鉴

管政兵1,2

（1. 江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122；

2. 江南大学生物工程学院，江苏无锡，214122）

摘要：人体潜在致癌物-氨基甲酸乙酯（EC）是发酵酒精饮料（中国黄酒、葡萄酒、日本清酒等）酿造过

程中伴随产生的副产物，不少国家对市场上各酒种中的EC含量制定了严格的限定标准。黄酒是我国特有

传统酒种，当前黄酒中EC含量较高的现状已成为制约我国黄酒业发展尤其是国际化发展的瓶颈之一。本

文就近些年国内外已报道的酿造酒中EC形成机理及控制策略研究的现状进行综述，并分析给予中国黄酒

的借鉴作用，以期为解决中国黄酒的EC问题提供思路。

关键词：发酵酒，氨基甲酸乙酯，尿素，酿酒酵母，代谢工程

Research progress in the control of ethyl carbamate in fermented alcoholic beverages and its

references giving for Chinese rice wine

GUAN Zheng-bing 1,2

(1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;

2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Abstract: The probable human carcinogen ethyl carbamate (EC) is the brewing byproducts of fermented alcoholic

beverages (Chinese rice wine, wine, Japanese sake, etc.). Many countries developed strict limitation standards on

the EC content in various kinds of wine on the market. Chinese rice wine is a unique, traditional wine in China. At

present, high levels of EC content in Chinese rice wine has become a serious bottleneck in the development,

especially in the international development, of the industry of Chinese rice wine. This review focused on the EC

formation mechanisms and controlled strategies to fermented alcoholic beverages, and analyzed the references

giving for Chinese rice wine to sovle its EC problem.

Key words: fermented alcoholic beverages; ethyl carbamate; urea; saccharomyces cerevisiae; metabolic

engineering

中图分类号：TS262.4 文献标识码：A

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate, 简称EC），俗称尿烷、乌拉坦(Urethane)，分子式为NH2COOC2H5(CAS# 51-79-6)，分子量89.09，无色无味晶体。现被广泛应用于医药、农药、香料

的中间体，用于生产安眠药、镇静剂，以及用作马钱子碱、间苯二酚的解毒剂、杀菌剂、注射剂

的助溶剂和印染工业着色剂等[1]。动物毒理学试验显示，EC对多个物种（包括小鼠、大鼠、仓

鼠、猴）具有致癌作用，能引起动物肺癌、淋巴癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌等恶性肿瘤

的发生，表明EC是人类潜在的致癌物质[1-2]。进一步研究其致癌分子机理发现EC主要通过两条

资助项目：国家自然科学基金项目(31101331)；高校博士点基金项目(20110093120002)

作者简介：管政兵(1981—)，男，副教授，博士，研究方向为食品科学与工程。

途径引发致癌效应：一是约0.5%的EC被细胞色素P450氧化为乙烯基-氨基-甲酸乙酯，接着形成乙烯基-氨基-甲酸乙酯环氧化物，这种环氧化物在体内形成DNA加聚物，造成DNA双链破坏，从而导致癌变；二是约0.1%的EC被细胞色素P450氧化为N-羟基—氨基甲酸乙酯，后者能诱导Cu2+调控的DNA碱基突变(多发生于胸腺嘧啶和胞嘧啶残基)，此条途径被认为是EC致癌的主要途径[3-4]。1974年，EC被世界卫生组织（WHO）下属的国际癌症研究机构（IARC）划为2组B 类可致癌物质[5]；2007年3月，IARC进一步提高了EC的致癌风险等级，将其划分进2组A类可致癌物质名单[6-7]。

EC是一些发酵食品（如各种发酵酒精饮料、酱油、发酵豆腐乳、面包等）生产过程中伴随产生的副产物，其中EC含量最高的是乙醇含量较高的酒精饮料[8-11]。在各类酒精饮料中，酒精含量较低的啤酒中EC含量非常低，而在蒸馏酒、中国黄酒、日本清酒、葡萄酒中含量较高[8-11]。鉴于人体对EC的摄入绝大部分是来自酒精饮料的饮用，欧美发达国家纷纷对市场上各类酒精饮料制定了EC限量标准，如加拿大和捷克共和国规定葡萄酒（wine）和加度葡萄酒（fortified wine）的EC含量分别不能超过30和100 μg/L；美国规定该两种酒的EC含量分别不能超过15和60 μg/L [1,6,11]。世界各国非常重视EC控制措施的研究，如1997年美国食品与药品管理局（FDA）和加利福利亚大学戴维斯分校葡萄酒学院联合公开发布了《葡萄酒EC控制手册》（《Ethyl Carbamate Preventative Action Manual》）；2006年欧洲食品安全局（EFSA）也启动了若干关于酒精饮料中EC形成机理和控制措施研究的科技项目[1,6]。

1酿造酒中EC的来源

1.1尿素（Urea）—EC的主要前体

研究表明，尿素是EC的主要前体物质，发酵酒中90%以上的EC是来自尿素与乙醇自发反应生成的（见下述化学反应式）[1,9,12-18]。尿素浓度、乙醇含量、温度及反应时间等各个因素都与EC生成量呈正相关关系。尿素浓度越高，乙醇含量越大，温度越高，反应时间越长都会促进EC 生成的自发反应[14-20]。

化学反应式：NH2CONH2 （尿素）+ C2H5OH （乙醇）→ NH2COOC2H5 （EC）+ NH3

1.2发酵液中绝大部分尿素的来源及分子水平产因

黄酒酿造中，所使用的原料、辅料及酿造用水会带入少许尿素，但发酵液中尿素的绝大部分来源还是在酒精发酵过程中由黄酒酵母代谢精氨酸产生再分泌到胞外的[10,17,20]。精氨酸是酿酒原料中含量较高的一种氨基酸，是酵母菌生长繁殖利用的重要氮源之一。精氨酸经精氨酸酶（arginase；CAR1基因编码）——脲基酰胺酶（urea amidolyase；DUR1,2基因编码）路径最终被分解为氨（NH3）和二氧化碳（CO2)（图1）。酿酒酵母生长繁殖时，酵母细胞优先利用氨这种能快速获取、容易代谢的底物作为第一氮源；当氨利用完毕或不存在时，酵母才开始利用尿素作为氮源。酵母细胞区别不同氮源的分子机制被称之为氮分解代谢物阻遏作用（nitrogen catabolite repression，简称NCR），其调控原理是被优先利用的氮源的中间代谢物能够阻遏利用其他氮源的

酶编码基因的起始转录[21-24]。

在酒精发酵阶段，酵母胞内精氨酸酶基因（CAR1）的表达水平很高，精氨酸大量水解为尿素和鸟氨酸；由于酵母优先利用已足够积累的氮源—氨，使得脲基酰胺酶基因（DUR1,2）受到NCR调控作用，起始转录被阻遏，基因表达水平很低，远低于精氨酸酶基因的表达水平，从而导致多余尿素不能被及时分解；过量积累的尿素对细胞具有毒性，因此随即被尿素转运蛋白（DUR4基因编码）转运出细胞，最终导致发酵液中的尿素含量大幅增加[22-25]（图1）。

图1 酿酒酵母酒精发酵阶段精氨酸的转运和代谢途径

Fig. 1 Arginine transport and catabolism during yeast alcoholic fermentation

精氨酸由酵母细胞膜上的氨基酸透性酶（GAP1编码）或精氨酸特异性透性酶（CAN1编码）转移进入胞内，在精氨酸酶（CAR1编码）的作用下水解为鸟氨酸和尿素。少部分尿素在辅助因子A TP和Biotin的作用下进一步被脲基酰胺酶（DUR1,2编码）分解为氨（NH3）和二氧化碳（CO2）；由于细胞优先利用NH3作为氮源，大部分多余的尿素由细胞膜上的尿素转运蛋白(DUR4编码)携带分泌出胞外，进入发酵液。只有当酵母胞内缺少优先氮源时，胞外的尿素可由细胞膜上的另一尿素转运蛋白（DUR3编码)转运进入胞内。DUR1,2基因编码的脲基酰胺酶是一个双功能酶。在尿素的降解过程中，尿素首先被催化生成中间物脲基甲酸酯(Allophanate)，进一步被催化降解为氨和二氧化碳，两步催化反应均由脲基酰胺酶完成。

2目前国际上降低酿造酒中EC含量的主要策略

为了降低酒液中EC的含量水平，目前国际上通用的思路是设法降低发酵液中EC的主要前体物质——尿素的含量水平，以达到降低EC生成的目的[1,14-16,19-20]。总结现有相关文献和资料，主要采用的策略有以下三种：a.添加酸性脲酶（尿素水解酶）酶制剂；b.利用精氨酸酶基因（CAR1）缺失的低产/不产尿素酿酒酵母；c.通过高表达脲基酰胺酶基因（DUR1,2）构建低产尿素的酿酒酵母。

2.1添加酸性脲酶法

向发酵液中直接添加外源酸性脲酶使尿素及时分解为氨和二氧化碳，从而可以减少尿素与乙醇发生反应生成EC[26-27]。目前美国、日本等生产的酒用酸性脲酶（分别来源于一株发酵乳酸菌和节杆菌）已实现了商业化[26-27]。例如，根据日本出售的酸性脲酶酶制剂说明书描述：添加80g 的酶制剂于10t清酒发酵液，可使发酵液中的尿素含量在7d后从30mg/L下降到只有2~5mg/L。

此方法的缺点是企业需大量购买价格昂贵的商品化酸性脲酶，从而会导致生产成本增加。并且同样的酸性脲酶在不同pH和酒精浓度环境下，尿素降解效率也有所不同。同时，由于添加酸性脲酶后一般需作用若干时间后才能确保尿素被充分分解，因而会导致酒的生产周期延长[26-27]。到目前为止，我国还没有自主生产酒用酸性脲酶酶制剂的能力，国内黄酒、葡萄酒等生产企业如果需使用必须依靠进口[20]。

2.2利用基因工程技术或诱变法

根据酿酒酵母胞内精氨酸的代谢途径，利用基因工程技术构建或物理化学诱变技术筛选精氨酸酶基因（CAR1）缺失的酿酒酵母进行发酵酒酿造，弱化精氨酸降解途径，使得酵母无法水解精氨酸生成尿素，从而阻止EC生成，也是策略之一[1]。

上世纪90年代初，日本国立酿造研究所利用同源重组原理敲除2个CAR1的等位基因（CAR1-/-）使酵母不能利用精氨酸，构建了不产尿素的清酒酵母菌株。研究发现，经该菌株酿造的清酒，EC含量大幅下降，而且酒液即便经过6个月的储存，EC含量也无上升[28,29]；2007年，德国osnabrueck大学科学家同样利用同源重组原理构建了2个CAR1等位基因都被敲除的核果蒸馏酒酵母菌株，利用该菌株酿造的核果蒸馏酒（stone-fruit spirits）EC含量大幅下降[25]。由于上述两项研究构建的基因工程菌株都使用了抗生素抗性基因作为筛选标记，不具备食品安全性，因此都未能应用到实际工业生产中。

利用检测精氨酸酶活力缺失或下降的“CAO”培养基为“筛子”，日本科学家分别利用紫外线照射和化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）成功地筛选到了CAR1基因发生突变的低产尿素的清酒酵母菌株[30-31]；在国内，中国食品发酵工业研究院王德良等人[32]最近通过He-Ne激光和亚硝基胍复合诱变法也筛选得到了一株CAR1突变的低产尿素黄酒酵母菌株，利用该突变株进行小试规模的黄酒发酵试验显示，发酵液中尿素含量下降了52.15%。

使用精氨酸酶基因缺失的酿酒酵母可在不增加企业成本的基础上从源头上解决酒液中的EC 问题，但此策略的缺陷是由于精氨酸是酿酒原料的主要氨基酸种类之一，且是酵母发酵时利用的重要氮源，因此酵母精氨酸酶基因的缺失可能会导致酵母的发酵力有所减弱，影响发酵速度。

2.3利用代谢工程原理构建高表达脲基酰胺酶基因（DUR1,2）的低产尿素酿酒酵母

如前所述，酿酒酵母在酒精发酵阶段由于DUR1,2基因表达受到氮分解代谢物阻遏（NCR）调控，胞内脲基酰胺酶活力很低，不能及时降解精氨酸水解所产生的大量尿素，从而导致了多余尿素被酵母分泌到胞外而与乙醇反应生成EC。

2006年，加拿大著名的英属哥伦比亚大学葡萄酒研究中心van Vuuren教授团队利用代谢工程手段，在葡萄酒工业酵母菌株UC davis 522基因组中整合入一个组成型高表达脲基酰胺酶的基因盒（PGK1p-DUR1,2-PGK1t），强化了尿素降解途径，大幅减少了酵母分泌到发酵液中的尿素量，使生产的葡萄酒中EC含量下降了89.1%。研究人员通过采用基因工程“自克隆”技术（“self-cloning” technique），使低产尿素的工程菌株UC davis 522EC-未引入外源物种DNA；进一步的遗传学、发酵性能及比较转录组学分析表明工程菌株522EC-与出发菌株522具有“实质等同性”（substantial equivalence），因此获得了美国FDA的GRAS（Generally Regarded As Safe）[33]食品安全性认证，FDA、加拿大健康署（Health Canada）及加拿大环境署（Environment Canada）同时批准了其工业化应用[34]。

2010年，van Vuuren教授团队继续以日本清酒常用工业酵母菌株K7和K9为改造对象，利用相同方法构建了低产尿素工程菌株K7 EC-和K9 EC-，清酒小试发酵显示K7 EC-和K9 EC-较出发菌株EC含量分别下降了87%和68%，进一步对工程菌株K7EC-与出发菌株K7进行遗传学、发酵性能及转录组分析同样表明两者具有“实质等同性”，目前K7EC-正申请美国FDA的GRAS认证中[35]。

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