哈萨克族食管癌患者组织中细胞外信号调节激酶丝裂原活化蛋白激酶

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．基础研究．

哈萨克族食管癌患者组织中细胞外信号调节

激酶／丝裂原活化蛋白激酶信号通路的表达

郑树涛刘涛阿孜古丽?吐尔逊霍奇刘清黄丛改冯军国吕国栋王星

林仁勇伊力亚尔?夏合丁卢晓梅

【摘要】目的探讨细胞外信号调节激酶（ＥＲＫ）／丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）信号通路在哈

萨克族食管鳞癌患者组织中的表达变化及意义。方法采用ｗｅｓｔ唧ｂ１０ｔ技术检测在血清饥饿条件

下、Ｕ０１２６梯度浓度处理下，食管癌细胞系Ｅｃ９７０６中磷酸化ＥＲＫｌ（ｐ－ＥＲＫｌ）和磷酸化ＥＲＫ２

（ｐ－ＥＲＩ（２）的表达变化。采用实时荧光定量ＰＣＲ法检测２５例哈萨克族食管癌患者肿瘤组织和癌旁

正常组织中总ＥＲＫｌ（ｔ－ＥＲＫｌ）和总ＥＲＫ２（ｔ—ＥＲ配）ｍＲＮＡ的表达变化。采用ｗｅ８ｔｅｍｂｌｏｔ技术检测

２５例哈萨克族食管癌患者肿瘤组织、癌旁正常组织以及５例哈萨克族非食管癌者正常食管组织中

ｔ．ＥＲＫｌ、ｔ—ＥＲ勉、ｐ．ＥＲＫｌ和ｐ．ＥＲｌ（２蛋白的表达变化。采用免疫组化染色法，在１２６例石蜡包埋标本

（正常食管黏膜１９例，食管原位癌５５例，食管浸润癌５２例）中验证ｐ－ＥＲＫｌ和ｐ．ＥＲＫ２蛋白的表达变

化。结果在食管癌ＥＣ９７０６细胞中，ＥＲＫ／ＭＡＰＫ信号通路呈高度活化状态。血清瞬时刺激１０血ｎ

后，ｐ－ＥＲＫｌ和ｐ—ＥＲｌ（２的表达达到峰值。ＥＣ９７０６细胞在５０斗ｍｏＬ／Ｌ的Ｕ０１２６处理下，ｐ—ＥＲＫｌ和

ｐ．ＥＲｌ（２的表达几乎完全被抑制。ｔ．ＥＲＫｌｍＲＮＡ在２５例哈萨克族食管癌患者肿瘤组织中的表达量为

１．９２±３．４９，明显低于癌旁组织（３．６７±７．４７，Ｐ＜０．０５）；ｔ—ＥＲＫ２ｍＲＮＡ在食管癌组织和癌旁组织中

的表达量差异无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。ｔ—ＥＲＫｌ和ｔ—ＥＲＫ２蛋白在食管癌组织、相应癌旁组织和正常

食管黏膜组织中的表达差异无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５）；但ｐ－ＥＲＫｌ和ｐ—ＥＲｌ（２蛋白在食管癌组织中的

表达量（分别为０．８７±０．１４和Ｏ．７９±Ｏ．１０）均明显低于癌旁组织（分别为１．１０±Ｏ．１３和１．３２±

０．１２，Ｐ＜Ｏ．０５）和正常食管黏膜组织（分别为１．５０±Ｏ．２２和１．６４±Ｏ．１８，Ｐ＜Ｏ．０５）。免疫组化染色

验证的结果显示，ｐ－ＥＲＫｌ和ｐ—ＥＲＩ（２蛋白在浸润性食管癌组织中的阳性表达率均为７．７％（４／５２），在

癌旁正常食管黏膜组织中的阳性表达率均为３１．６％（６／１９），在食管原位癌组织中的阳性表达率均为

８５．５％（４７／５５），不同组织间的表达差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５）。结论在食管癌细胞中，ＥＲＫ／

ＭＡＰＫ信号通路呈活化状态。ＥＲＫ／ＭＡＰＫ信号通路活化水平的改变可能参与了哈萨克族食管癌患

者肿瘤的早期发生。

【主题词】食管肿瘤；哈萨克族；细胞外信号调节激酶／丝裂原活化蛋白激酶信号通路

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基金项目：国家自然科学基金（３０７６０２２３、３０８６００９７）

作者单位：８３００５４乌鲁木齐，新疆医科大学第一附属医院医学研究中心（郑树涛、刘涛、阿孜古丽?吐尔逊、霍奇、刘清、黄丛改、冯军国、吕国栋、王星、林仁勇、卢晓梅）；新疆维吾尔自治区食管癌研究所（伊力亚尔?夏合丁）

通信作者：卢晓梅，ＥⅢ｜ｉｌ：ｌｕ五蛐ｅｉ８８＠１６３．ｃ∞

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丝裂原活化蛋白激酶（ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＭＡＰＫ）通路是细胞内重要的信号转导系统，具有调节细胞增殖等多种功能。细胞外信号调节激酶（ｅｘｔｍｃｅＵｕｌａｒｓｉｇＩｌａｌ—ｒｅｌａｔｅｄｋｉｎａｓｅ，ＥＲＫ）通路是该系统中迄今为止研究最主要的一条，主要参与调节细胞的生长和增殖分化过程¨引。ＥＲＫｌ和ＥＲｌ＜２活化（磷酸化）后，从细胞质转移到细胞核，磷酸化和活化核内的效应分子，其中包括转录因子，最终启动与细胞增殖、分化有关的靶基因转录∞Ｊ，发挥促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等多种效应。有研究表明，ＥＲＫ／ＭＡＰＫ信号转导通路活化水平的改变与多种肿瘤的发生有关Ｈ１。本研究中，我们应用实时荧光定量ＰｃＲ法检测哈萨克族食管癌患者肿瘤组织和癌旁正常组织中总ＥＲＫｌ（ｔ—ＥＲＫｌ）和总ＥＲ怼（ｔ—ＥＲ磁）ｍＲＮＡ的表达水平，采用ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ和免疫组化染色法检测ｔ—ＥＲＫｌ和ｔ—ＥＲＫ２以及磷酸化ＥＲＫｌ（ｐ—ＥＲＫｌ）和磷酸化ＥＲＫ２（ｐ—ＥＲＫ２）蛋白在哈萨克族食管癌患者肿瘤组织、癌旁正常组织以及哈萨克族非食管癌者正常食管组织中的表达水平，旨在探讨ＥＲＫ／ＭＡＰＫ信号转导通路在哈萨克族食管癌患者肿瘤发生中的作用。

材料与方法

一、材料

１．细胞株和食管癌组织标本：食管癌细胞系Ｅｃ９７０６购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。２５对手术切除的哈萨克族食管癌患者肿瘤组织和癌旁正常食管组织以及５例由食管镜取材的哈萨克族非食管癌者正常食管组织，均为新疆医科大学第一附属医院医学研究中心标本库液氮中保存的新鲜组织。另外，收集１２６例哈萨克族人食管石蜡包埋组织样本（癌旁正常食管黏膜１９例，食管原位癌５５例，食管浸润癌５２例）进行免疫组化检测，所有样本均经病理医师核实诊断。

２．主要抗体和试剂：兔抗ＥＲＫｌ、ＥＲＫ２和兔抗ｐ—ＥＲＫｌ、ｐ—ＥＲＫ２抗体均购自ｃｅⅡｓｉｇｌｌａＨｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司。兔抗人ｐ—ｔｕｂｕｌｉｎ抗体、羊抗兔ＩｇＧ－辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）抗体和二氨基联苯胺（ＤＡＢ）显色试剂盒均购自北京中杉金桥公司。ＲＩＰＡ蛋白裂解液、ＢｃＡ蛋白定量试剂盒购自北京百泰克公司。ＲＮＡ逆转录试剂盒、ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ反应试剂盒均购自大连宝生物ＴａＫａＲａ公司。’ｍｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ公司。ＲＰＭＩ１６４０培养基和胎牛血清（ＦＢＳ）购自ＧＩＢＣＯ公司。胰蛋白酶购自Ａｍｒｅｓｃｏ公司。其余试剂均为国产分析纯。

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