哈萨克族食管癌患者组织中细胞外信号调节激酶丝裂原活化蛋白激酶(2)

二、方法

１．细胞培养：食管癌细胞Ｅｃ９７０６常规培养于含１０％ＦＢｓ的ＲＰＭＩ１６４０培养液中，并放置于３７℃、５％ｃＯ：孵箱中。以０．２５％的胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，传代培养用于后续实验。

２．食管癌及癌旁组织蛋白的提取：将干净的研钵用液氮提前预冷，将１００ｍｇ组织在液氮中研磨成粉末状，然后加入１ＩＩｌｌ的ＲＩＰＡ裂解液，继续研磨。将蛋白转移到１．５ＩＩｌｌ的Ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ管中，１２０００

ｒ／ＩＩｌｉｎ、

史生＆盥＆ｉ』Ｕ呈ｉⅡ￡！盅￡！驵ｊ』叫ｊ型Ｌ女＆＆Ｕ●垫兰．业

４℃离心１０ｍｍ。取Ｌ清．ＢｃＡ法蛋白定量，分装．一２０℃保存。３食管癌厦癌旁组织总ＲＮＡ的提取：采用酬法提取组纵的总删Ａ，将符合标准的总ＲＨＡ进行逆转录。４实时荧光定量ＰｃＲ法检测ｔ—ＥＲＫｌ和ｌ＿ＥＲＫ２ｍＲＮＡ的表达：ＥＲＫｌ、ＥＲＫ２和内参照Ｂ－ａ血ｎ的引协亭列由大连宝生物恤Ｉｉ且公司畦计合成，引物序列见表Ｉ。采用ｓＹＢＲ绿色荧光染料试剂盒．按照试剂盒说明书采用两步法进行反应。反应程序如下：职Ｋｌ：９５℃３０ｓ，９５℃５Ｂ，５７８℃３０ｓ，共帅个循环；ＥＲＫ２：９５℃３０ｓ，９５℃５ｓ，５７℃３０８，共４０个循环，Ｂ啦ｔｌｎ：９５℃３０ｓ，９５℃５ｓ。５５ｔ３０ｓ．共帅个循环。５ｗ∞ｋｍｈ１０ｔ法检测ｔ—ＥＲＫｌ、ｔ一跳Ｋ２、ｐ－ＥＲＫｌ和ｐ－ＥＲＫ２蛋白的表达：将Ｅｃ９７０６细胞进行血清饥饿２４ｈ．用含有１０％邝ｓ的培养浦分别培养

１０、３０、６０、ｌ如和３００ｍｍ，然后进行ｗｅｓｌｅＴ”Ｈｍ检测。将食管癌细胞Ｅｃ９７０６接种于６孔培养板，４８ｈ后（细胞的融合达到８０％左右）以Ｏ、ｌＯ、２０、３０、４０、

５０肿ｌｏＦＬ的Ｕ０１２６作用于呦枷细胞，０５ｈ后消化收集细胞于离心管中。用预冷的磷酸盐缓冲液

（ＰＢｓ）冲洗细胞２次，每管加＾Ｒ雌裂解渡３０“，

１２０００∥ｍｉｎ离心５ｍｎ，收集上清，ＢｃＡ法蛋白定

量，分装后于一２０℃保存。取５０Ｉｌｇ总蛋白进行十

二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｓＪ）ｓ—ＰＡＧＥ），然后转至聚偏氟乙烯（ＰｖＤＦ）膜上，于５％脱脂奶粉中室温封用２ｈ，再与抗ＥＲＫｌ、ＥＲＫ２或抗ｐ－ＥＲＫｌ、ＰＥＲＫ２抗体作用，４气过夜，ＰＢ邬洗３次，每状５ｌ＿】ｉｎ。加＾抗兔ｋＧ－ＨＩＩＰ室温反应２ｈ，ＰＢｓＴ洗４攻，每攻

６…，ｎＡＢ显色试剂盒检测。利用Ｑｕ粕ｔ畸０ｍ软件进行灰度扫描，计算嗳光度（＾）值。每组实验重复３次。同样方法检测组织标本中ｔ?ＥＲＫｌ、ｔ－ＥＲＫ２及Ｐ－ＥＲＫｌ、ｐ－ＥＲＫ２蛋白的表达水平。６免疫组化染色法捡测组织标本中ｐ—ＥＲＫｌ和ｐ－ＥＲＩ（２蛋白的表达：采用非生物索即用型二步法检测试剂盒（北京中杉金挢生物技术有限公司）进行免疫组化检测。组织标本石蜡切片脱蜡，３％过氧化氢－无水乙醇处理１０一。以阻断内源性过氧化物

酶，ＰＢｓ缓冲液漂洗，置于枸橼酸盐缓冲液中．微波

加热抗原修复３０～，室温冷却后．滴加抗ｐ－ＥＲＫｌ和ｐ－ＥＲＫ２，４℃湿盒过夜。ＰＢｓ缓冲掖冲洗切片，滴加ＨＲＰ标记的二抗，室韫孵育如皿ｎ。ＰＢｓ缓冲液

冲洗切片，ＤＡＢ显色，蒸馏水终止反应。苏禾精复

染，脱水，透明，封固。以ＰＢｓ代替一抗作为阴性对照。每张切片随机选择５个高倍视野，计算阳性细胞所占的百分数，其中阳性细胞数（１０％为阴性，≥

１０％为阳性。

三、统计学方法

膻用微软Ｍ?ｃｒｏｍｎＥｘｃｅＩ２００３版软件进行统计

分析。计鼍资料以ｉ±ｓ表示，两组问均数比较用‘榆验．以Ｐ＜Ｏ０５为差异有统｝｜学意义。结果

ｌ食管癌Ｅｃ卯０６细胞的血清饥饿实验结果：以ｂＥＲＫｌ和Ｉ—ＥＲ也为内参照，刺激１０ｍｍ时，ｐ－

ＥＲＫｌ和ｐ—ＥＲＫ２的表达水平达１４峰值（图ｔ）。

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目１

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ｍ镕ｎｎＲＰＥＲＫｌ＃ｐ－呲Ⅲ自∞女ｔ女十２Ｕ０１２６对食管癌Ｅ０９７０６细胞中ｐ－ＥＲＫＪ、ｐ也ＲＫ２和ｔ－ＥＲＫｌ、ｔ—ＥＲ比蛋白表达的影响：ｐ—ＥＲＫｌ和ｐ—ＥＲＫ２蛋白的表达随着Ｕ０１２６雏度的增加逐渐下降，当Ｕ０１２６选到５０“Ⅱ彬Ｌ时，ｐ－ＥＲＫｌ和ｐ—ＥＲＫ２蛋白几乎无表达；而【一ＥＲＫ１和ｔ－ＥＲｌ（２

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蛋白的表达却不受ｕ叭２６作用的影响（幽２

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３啃萨克族食管癌患种刖，瘤组织及癌旁正常组织中ｔ－ＥＲＫｌ和ｔ—ＥＲＫ２ｍＲＮＡ的表达：ｔ－ＥＲＫｌｍＲＮＡ在茁例食千｝癌组织巾的相对表达量为ｌ

９２±３

４９，明湿低于相应的痛旁正常组织（３

６７±７

４７．

Ｐ（ｏ

０５），ｔ－ＦＲｌ（２ｍＲＮＡ在２５例食管癌组织中帕

槲对表达量为１６４３±１３

０２，虽低于相应的癌旁组

织（２２

８７±２４

８２），但篮异尤统计学意义

（Ｐ＞００５，图３）。

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４喑萨克族食管癌忠者肿瘤组纵、癌旁正常组织“及哈萨克族非食管癌者正常食管组织中

Ｌ，ＥＲＫ】、ｔ－ＥＲＫ２、ｐ—ＥＲＫｌ和ｐＥＲＪ（２蛋白的戒达：

ｔ—ＥＲＫ】在２５倒食管癌及相成癌旁组纵和５例食管正常黏膜ｌＨ纵中的相对表选蚺分别为ｏ

９２±０瞰

０９６±０１ｌ和ｌ

０７±０１５，差异尤统计学意义（Ｐ）

貔

ｏ

０５）；ｉ—ＥＲＩ（２在２５例食管癌及相鹰癌旁组织和

５例食恃止常黏腆￡Ｈ织中的相刈表达量分别为ｌ

１８±

０

１４、ｌ

２２±０２０和１”±Ｏ

１５，差异亦无统计学

意义（Ｐ＞Ｏ０５，图４）ｐ－ＥＲＫ【在２５例食管癌盟相廊癌旁组彝｛和５例食管ｌＦ常黏膜组织?｜ｌ的十Ｕ刖在逃量分别为０

８７±０

１４、ｌ

１０±０

１３和Ｉ５０±Ｏ２２，

差异有统计学意义（Ｐ（００５）；ｌｐＥＲＫ２在２５例食

管癌及相应痛旁组０㈣５例食管正常黏膜组织中的

相对表达馘分别为０神±０

１０、ｌ

３２±０

１２和ｌ６４±

Ｏ

１８．差异亦有统计学意义（Ｐ＜００５，幽４）．

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５免疫组化榆测结果：ｐ－ＥＲＫｌ和ｐ—ＥＲＫ２的阳性表达产物位于细胞核和卸１胞浆中，旱棕红色颗粒

（俐５）。ｐＥＲＫｌ和ｐＥＲＫ２蛋白枉浸润性食管癌

组织中的阳性表达Ｊ阜均为７７％（４／５２），在癌旁正常食管黏膜组织中的刖性裘达事均为３ｌ６％（６／１９），在食管原位癌组纵中的阳性表达卒均为８５

５％

（４７／５５），不问组织问的表达差异有统计学意义

（Ｐ（００５）。

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讨论

ＥＲ酝是ＭＡＰＫ家族的一个亚族，包括ＥＲＫｌ和ＥＲｌ（２。ＥＲＫｌ和ＥＲｌ（２通路是ＭＡＰＫ信号转导系统的主要通路，参与细胞的生长、分化及凋亡等生理过程，并在肿瘤发生中起重要作用【ｌＪ。ＥＲＫｌ和ＥＲＫ２是受外界刺激时决定细胞命运的关键性因素，它能促进细胞增殖，决定细胞向终末期分化或发生凋亡口Ｊ。越来越多的证据表明，ＥＲＫ／ＭＡＰＫ信号通路在肿瘤细胞中被异常地调节，在肿瘤的发生和生长维持中起重要作用ＨＪ。

本研究中，我们采用高浓度ＭＥＫ特异性阻断剂Ｕ０１２６作用于食管癌Ｅｃ９７０６细胞，结果显示，ｐ—ＥＲＫｌ和ｐ—ＥＲＫ２蛋白的表达水平被明显抑制，表明ＥＲＫ／ＭＡＰＫ信号通路在食管癌中呈高度活化状态。同时我们还在２５例哈萨克族食管癌患者肿瘤标本中探讨了ＥＲＫ／ＭＡＰＫ信号通路的作用。结果显示，ｔ．ＥＲＫｌｍＲＮＡ在食管癌组织中的相对表达量明显低于相应的癌旁正常组织（Ｐ＜０．０５）；ｔ—ＥＲＫ２ｍＲＮＡ在食管癌组织中的相对表达量虽低于相应的癌旁组织，但差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。

为了进一步验证ＥＲＫｌ和ＥＲＫ２在哈萨克族食管癌患者肿瘤发生中的作用，我们采用ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ法检测了哈萨克族食管癌患者肿瘤组织、癌旁正常组织以及哈萨克族非食管癌者正常食管组织中ｔ—ＥＲＫｌ、ｔ—ＥＲｌ＜２、ｐ—ＥＲＫｌ和ｐ—ＥＲ慰蛋白的表达。结果表明，ｔ—ＥＲＫｌ和ｔ—ＥＲＫ２蛋白在２５例食管癌及相应癌旁组织和５例食管正常黏膜组织中的相对表达量差异无统计学意义（Ｐ＞ｏ．０５）；但食管癌组织中ｐ－ＥＲＫｌ和ｐ－ＥＲＩ（２蛋白的表达显著低于癌旁组织和正常食管黏膜组织（Ｐ＜Ｏ．０５）。而多数研究结果表明，ＥＲＫｌ和ＥＲＩ（２在肿瘤组织中的表达高于相应的癌旁组织和正常组织ｂ引，与本研究结果差异较大。

免疫组化扩大样本验证的结果显示，ｐ—ＥＲＫｌ和ｐ．ＥＲｌ（２在哈萨克族食管鳞癌患者肿瘤组织中的活化水平显著低于癌旁正常食管组织，而在原位癌中的表达明显高于正常食管组织。ｐ—ＥＲＫｌ和ｐ－ＥＲ怼可以将细胞外刺激信号从细胞质传递到细胞核，而原位癌期的肿瘤细胞会独立于这些细胞外刺激物质，但在晚期癌细胞中，控制核内细胞增殖分化靶基因的ｐ．ＥＲＫｌ和ｐ．ＥＲＫ２的作用可能逐渐减弱一Ｊ，导致食管癌旁正常组织中ｐ—ＥＲＫｌ和ｐ—ＥＲＫ２的表达高于食管浸润癌组织。这与柏素云等ｕ训的报道一致。提示ＥＲＫ／ＭＡＰＫ通路活化水平的改变可能参与了哈萨克族食管癌患者肿瘤的早期发生。

参考文献

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