丝羽乌骨鸡BAC文库的构建和黑色素相关基因TYRP1和ID的研究(4)

剂最来获得显著的重组。微小染色体中的一些有可能在ＲＨ中保持完整但是会很快消失。另外

由于ＲＨ克隆可能很快会将外源染色体排除在外．因而克隆应冻存。

鸡的放射杂交板由法国的Ｖｉｇｎａｌ等人构建成功（Ｍｉｒｅ川ｅＭｏｒｏｓｓｏｎ等，２００２），但是仍未包含

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主星銮些查兰彗土茎竺丝耋，，，，，，，，。。，，，，，。，。。，，。。。，。，。。，。二呈二茎，ｉ；些耋查所有的染色体。但这为鸡的基因的物理定位提供了一个极为有用的工具。

１．１－２２．５ＢＡＣ或ＹＡＣ重叠群构建基因组物理图谱

这里的基因组物理图谱是指一系列ＤＮＡ的限制性酶切片段沿染色体的有序排列形式。物理图谱的构建是通过哲落杂交，ＰＣＲ和ＤＮＡ指纹等方法来确定克隆之闻的重叠关系，将顺序重叠的克隆片段排列在一起。

制作重叠克隆群需要具有一定容量的大片段基因组文库。重叠克隆群的制作有三种方法。

Ａ．菌落杂交法。其基本原理是利用基因组某一区域特有的或与所需分离的目的基因紧密连锁的ＤＮＡ分子标记为探针筛选大片段基因组文库．可以分别得到一系列的刚性克隆，这些克隆之间有部分片段是重叠的，根据其重叠部分可以把它们有序地呈线状排列成重叠群（ｃｏｎｔｉｇ）。在两个重叠群之间会出现空隙，需要通过染色体步行来填补。该技术从分离人片段阳性克隆群的左、矗末端入手以它们为探针再次筛选基因组文库，获得新的克隆即为沿着染色体向前走了一步．重复这一过程，就能一步一步地将空隙填满，将两个克隆群整合在一起。这一方法能利用各种分子标记扫描文库，准确得到携带分子标记的阳性克隆，是构建重叠克隆群的酋选燕略。

Ｂ．ＰＣＲ法。即以ＰＣＲ技术为基础发展的一系列技术。包括序列标签能点（ＳＴＳ）、随机扩增多态性（ＲＡＰＤ）、扩增的限制性内切酶多态性（ＡＦＬＰ）、ＤＮＡ扩增产物指纹分析（ＤＡＦ）和Ａｌｕ－ＰＣＲ（Ａｌｕ为出现于人及相关哺乳动物基因组中的一种短重复元件）等已被广泛应用于重叠克隆群的构建。ＳＴＳ策略是利用已知核苷酸序列．从两端合成两个与其配对的引物，利用ＰＣＲ进行扩增，理论上讲具有相同扩增带型的亮隆，即共享一个或数个ＳＴＳ位标的克隆肯定是重叠的。这个方法具有简便、快速、精确度高等优点，是人类基因组计划所采用的主要策略之一。

Ｃ．ＤＮＡ指纹法。其原理是首先对随机克隆的ＤＮＡ选定一个６碱基识别位点的限制性内切酶消化，然后｝；｝ｊ放射性同位素进行末端标记，经标记后ＤＮＡ片段用另～个４个碱基识别位点的限制性内切酶消化，州序列分析胶分离这些片段，然后经放射性自显影检测。这些指纹图谱数据经计算机处理后，根据片段的相似性，构建重蹙克隆群。

１．１．２．２．６构建物理图谱所用的染色体分离技术

１．１．２２．６．１流式核型分析（ｆｌｏｗｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ）

流式核型分析是分离出单个染色体并进行分析的技术。大鼙染色体被分离并悬浮在液体中，＿Ｉ；｝ｉ荧光染料染色。单条染色体经过激光柱，按荧光模式分类。荧光模式由ＤＮＡ含量所决定，不同的荧光染料对特定序列有相应的亲和。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８特异亲和Ａ厂ｒ序列，Ｃｈｒｏｍａｒｎｙｃｉｎ

Ａ３与Ｇ／Ｃ区。该技术十分灵敏，因此应设法使其最优化，并使用最纯的染色体来避免精度丢

失ａ若能获得单个染色体．则能使用它们ＰＣＲ扩增，克隆成单个染色体文库，还可直接选择

ＹＡＣ构成单条染色体池。虽然流式核型分析在人和植物的应用中获得了巨大成功，但鸡的染色

体中人量的微小染色体使得分析精度降低而８对大染色体较易分析。流式细胞分析的变异性也

较高，需要用传统细胞遗传学方法证实，但这在鸡中也存在～定的问题。１．１．２．２．６．２染色体微分割（ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）

染色体微分割技术随着激光技术的发展而得以实现。将染色体固定于一个光圈中，用激光

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微光柱解剖后，用玻璃针移走。它的优点在于，可以将特定染色体的特定片段分离出来。微分割片段可以用于构建连续的大片段文库，并可用于基因定位研究（ＳｈａｗＥ．Ｍ．等，１９９６）。但是在鸡中分离出正确的染色体依然缺乏信息，因为微小染色体细胞学上不可分。这个技术同时也产生了一些微小的ＤＮＡ片段，使得克隆分割的片段较为困难。使用ＤＯＰ－ＰＣＲ（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｄ．ＰＣＲ）．用２２一ｍｅｒ的引物在复式退火温度条件Ｆ进行扩增．能生成用丁＝＿克隆的分割染色体的足量ＤＮＡ（ＡｒｕｍｕｇａｎａｔｈａｎＫ等，１９９４）。但分割片段的实际人小仍有１０Ｍｂ，较传统分子遗传学所得的７００ｋｂ要大的多。该技术可以为特定染色体的ＦＩＳＨ研究提供足够的ＤＮＡ。

１．１．２．２．６．３脉冲场凝胶电泳（ｐｕｌｓｅｄｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＰＦＧＥ）

ＰＦＧＥ是在琼脂糖凝胶上，在电场不同角度使用变化的电流，可以用于分离超过１Ｍｂ的大片段ＤＮＡ。该技术可分为多种方法，最普通的是钳式同源电场电泳（ｃｌａｍｐｅｄｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｆｉｅｌｄｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＣＨＥＦ）．它在琼脂糖胶的周围有一系列的电极。

该技术可以分离从１０ｋｂ到１０Ｍｂ的片段．这样就缩小了标准克隆系统，如质粒、噬菌体和粘粒载体间．以及遗传连锁图谱间的差异。随着酵母人１：染色体（ｙｅａｓｔａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．ＹＡＣ）技术和细菌人工染色体（ｂａｃｔｅｒｉａｌａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＢＡＣ）等技术的发展，ＰＦＧＥ对所有进行基因组定位研究的实验室变得更为重要。

１．１．２．３鸡的基因组物理图谱

世界上已有儿个鸡的基因组大片段ＢＡＣ文库构建成功用以构建鸡的基因组物理图谱。ＴｅｘａｓＡ＆Ｍ大学的Ｚｈａｎｇ，Ｄｏｄｇｓｏｎ等建了一个含大于１１５，０００ＢＡＣ克隆的文库，使用了三种不同的限制性内切酶来获得部分酶切的插入片段（ＬｅｅＭ．．Ｋ．等，２００３）。他们用的基因组来自～只雌性的野生红色原鸡（家鸡的祖先），它所属的家系曾用于构建用于构建遗传图谱的ＥＬ回交资源群。使用这种鸡有助于通过它的序列和其他商用或试验鸡种之间的比较寻找ＳＮＰ。

Ｚｈａｎｇ的试验室对分别来自３个酶切文库的ＢＡＣ克隆进行指纹分析，组台成重替群。整个基因组的ＢＡＣ重叠群物理图谱已于２００３年底完成并发表（ＣｈｅｎｇｗｅｉＲｅｎ等，２００３）。该物理图谱对５７，０９１个ＢＡＣ克隆（约７．９倍基因组覆盖率）用限制性酶切和高清晰度的聚丙烯胺电泳得到ＢＡＣ指纹图进行分析。该物理图谱包括２３３１个相互重叠的ＢＡＣ重叠群，估计覆盖了Ｉ５２０Ｍｂ的物理长度。ＢＡＣ重叠群用３６７个标记筛选进行确认。共有３６１个重叠群被定位｝ｑ现有的鸡的遗传图谱上。

鸡的基冈组洲序计划在美国华盛顿大学基因组中一Ｄ，（ｗｕｏｓｃ）、英国Ｓａｎｇｅｒ研究所及中国北方基冈组研究所暨华大基因组研究中心协同并进。项目分Ｊ：为：华盛顿大学中心测定６倍原鸡的基因组序列，中国和英国测定三个家鸡种１倍的序列以获得更多的ＳＮＰ资源。２００３年１２月，原始序列的测定完成，２００４年初，用鸟枪法测得的全基因组原始序列已经被锚定到ＢＡＣ重叠群上?覆盖大于６倍的鸡基因组。ＷＵＧＳＣ的ＢＡＣ重叠群物理图谱，来自１３３．０００个ＢＡＣ的指纹图，由２８０个重叠群组成，其中的２／３已被定能到遗传连锁图谱和染色体图谱上。将覆盖５．２倍基冈组的序列进行拼接，可以覆盖约１亿碱基．约９７％的基冈组．其中ＧＣ含量为４１％．包括＾总序列的７％ｆｆ＇３７３Ｍｈ的散在重复序列。因此估计整个基冈组应为１．１—１．２ＧｂＤ。

鸡的基因组序列和图谱已释放到公众数据库中。比如ＥｎｓｅｍｂＩ：

网站：ｈ堑Ｐ；丛塑幽坠￡ｎｓ￡堡垒！：Ｑ￡型；ＵＣＳＣ：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／；ＷＵＧＳＣ

鱼姐；丛ｇ璺旦鱼ｍ垦：型坠剑：趔丛垃画曼￡堡尘ｂｌ昼酲￡世。在ＮＣＢＩ的ＴｒａｃｅＡｃｈｉｖｅ和ＧｅｎｅＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）中也可查到释放的鸡基冈组序列。全部－｜＿＝作应在２００４年底完成。

１．２鸡的功能基因组研究

功能基冈绸学（后基冈组学）是研究基因在特定组织中、在发育的不同阶段或是疾病不同时期的功能及其表达情况（杜忠强，２００３）。基因的功能主要包括：生物化学功能．如作为蛋白质激酶对特异的蛋白质进行磷酸化修饰：细胞学功能，如参加细胞间和细胞Ｉ．１：ｌ的信号传递途径；发育上的功能，如参与形态建成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）等。基因的时空差异表达是生物发育、分化、衰老和抗逆等生命现象的分子基础。基因在不同组织、不同器官以及不同环境条件下的差异表达特征．为基冈功能的研究提供了重要的信息。

１．２．１从基因型到表型

功能基因组的研究审，除了对基因的识别和克隆之外，还应使＿｝＝Ｉｊ各种策略和技术手段将基因与动物的表型性状联系起来进行分析。

１．２．１．１ＲＮＡｉ技术

ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ），即ＲＮＡ干扰技术，是指双链ＲＮＡ特异性的降解同源ｍＲＮＡ，从

而使同源基冈表达沉默的过程。它可作用于具有不同表达水平的基冈．最近在鸡中也获得了成功。化学合成的小链干扰ＲＮＡ（ｓｈｏＨｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）．一般十分有效。但价格较贵。体外转录的ＲＮＡ或质粒基础上的短发夹ＲＮＡ表达系统，有望今后起主导作用。

ＭｃＭａｎｕｓ和Ｓｈａｒｐ（ＭｃＭａｎｕｓＭ．Ｔ等，２００２）详细介绍了ｓｉＲＮＡ技术在哺乳动物中的应用，其中包括与免疫、疾病与基田功能有关的研究（ＧｉｔｌｉｎＬ．等，２００２；ＪａｃｑｕｅＪ．Ｍ．等，２００２；ＤｙｒｓｋｊｅｔＬ等，２００３）。ｓｉＲＮＡ起初在植物的转录后基因沉默（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．ＰＴＧＳ）中发现，其ｌ：艘达约为２１－２５个ＲＮＡ核营。其后在线虫中义发现了小链暂时ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｔｅｍｐｏｒａｌＲＮＡ，ｓｔＲＮＡ），其Ｋ＝度同ｓｉＲＮＡ相似，也约为２１．２３个ＲＮＡ核苛。

１．２．１．２转基因鸡与细胞系

鸡的细胞较难培养，但是现在已有许多细胞系可供使．Ｉ｛｛。如ＤＦｌ是成纤维细胞系，ＤＴ４０是病毒诱导的淋巴细胞系，能在外源ＤＮＡ导入后发生高效率的同源重组。因而ＤＴ４０细胞系也被ｊ‘泛麻Ｊ｛；ｊ丁基冈打靶和体细胞敲除，也可被用于体内操作克隆基闻米产生诱变，还可以被用丁建立人Ｌ．染色体。鸡的胚胎干细胞系也已建立，可以用ｒ嵌台体和转基冈鸡的研究（ＢｒｏｗｎＷ．Ｒ．Ａ．等，２００３）。

使用病毒载体就可以生产转基因鸡。但转基因的种系整合率很低。嵌合体鸡可以通过胚胎细胞的移植来生成，而转染胚胎细胞或选择转基因细胞来制造嵌合体的方法正在积极的研究之

中。从整体来说，鸡的转基因．Ｉ：作还需更多的努力。

１＿２２生物信息学

生物信息学是分子生物学和信息科学与技术、物理、数学等学科交叉、结合的产物，它的出现极大地推动了分子生物学的发展。生物信息学随着基因组计划的启动和推动而迅猛发展，它为基嗣组研究提供的海量数据是生物学历史上前所未有的。

利用计算机来协助克隆基因，被称为电子克隆，是与定位克隆、定位候选克隆并列的方法之一。同时，计算机分析是基因克隆中的重要手段，越来越多的基因克隆建立在生物信息学分析的基础上。进行同源性比对和计算机辅助结构、功能分析。尤其是ＥＳＴ技术的使用，为火规模进行基冈克隆和表达分析奠定了基础．也为生物信息学的功能的发挥提供了空间。

１．２．３渐成基因组学（ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ）

基冈组学的研究目的之一就是为详细阐述生命现象的复杂性提供参考数据，而构成细胞或有机体复杂功能特性的一个原因就是渐成学（ｅｐｉｇｅｎｅｓｉｓ）。渐成基因组学就是研究为基冈或接个基因组所提供的信息系统和运作规则的－－ｆ］科学，其中包括印迹（ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）、代谢网络、胚胎发育的遗传时空秩序以及基因作用的渐成遗传学机制等（Ｂｅｃｋｓ．等，１９９９）。基因的转录和翻泽过程受到多种因素的制约，与染色质相关的蛋白（连接组蛋白、转录因子）的重构、基因组甲基化、组蛋向的乙酰化、组蛋白组装及核小体形成的不同形式等，研究生物的渐成遗传学机制将提供生物的渐成基因型。基因组甲基化是基因组建成遗传修饰和基因绗功能调节的主要手段．ＤＮＡ甲基化可以改变ＤＮＡ与蛋白质之间的作用，提供非编码序列（包括内含子、重复序列、以及一些蕴藏着的活性转座成分）和发育相关基因沉默的可遗传机翻ｊ（ＫａｎｇＹ．．Ｋ．等，２００１）。组萤向除了（去）乙酰化外，还能发生磷酸化、甲基化和泛素化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ），它们影响着基因的活性状态。这些共价修饰之间也可能存在着联系（ＫａｎｇＹ．．Ｋ．等，２００２；ＫｕｒｄｉｓｔａｎｉＳ．等．２００３）。

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