丝羽乌骨鸡BAC文库的构建和黑色素相关基因TYRP1和ID的研究

中国农业大学

博士学位论文

丝羽乌骨鸡BAC文库的构建和黑色素相关基因TYRP1和ID的研究

姓名：刘薇

申请学位级别：博士

专业：生物化学与分子生物学

指导教师：李宁;胡晓湘

20040601

摘要

为研究丝羽鸟骨鸡体内黑色素合成和沉积的分子机制，本研究构建了丝羽乌骨鸡的基因组细菌人１：染色体（ＢＡＣ）文库。利用构建的ＢＡＣ文库对Ｚ染色体上黑色素相关基冈酪氨酸酶相关蛋白ｌ基冈（ＴＹＲＰＩ）的基冈结构以及该基因的表达与黑色素沉积的关系进行了研究，同时构建了位于ｚ染色体上缺乏标记区段的表皮黑色素抑制因子基因（／／３）的ＢＡＣ重叠群。

（一）本文构建了中国特有的丝羽鸟骨鸡的ＢＡＣ文库，结果如ｒ：

（１）该文库共有１３８，２４０个ＢＡＣ克隆（分为７２个超级池，每个超级池由２０块９６孔板组成）。

整个文库以两级３维的结构保存，建立了高效快速的ＰＣＲ筛选系统。

（２）对随机挑选的４５２个ＢＡＣ克隆的插入片段进行鉴定估计文库的平均插入为１１８ｋｂ，文库的基网组覆盖率为１３．３４倍，预计从文库中筛选到单拷贝基因的机率为９９．９８４％。用４０个微卫星标记和８个功能基因对整个文库进行ＰＣＲ筛选，得到的平均田｜性克隆数分别为１０．４２３和１１．１２５。对３２个ＢＡＣ克隆的荧光原能杂交结果表明，文库的最大嵌合率为６％。

对筛选得到的６个含ＬＭＢＲｌ序列的ＢＡＣ克隆酶切分析的结果表明ＢＡＣ克隆之间是相互重叠的。

（二）本文对ｚ染色体上与黑色素相关的基因ＴＹＲＰｌ和仍的研究结果如Ｆ：

（１）获得了１０，０６６ｂｐ的ｒ玎冲』的全长基因组序列，分析结果表明：丝羽鸟骨鸡的ＴＹＲＰｌ外显子与人的ＴＹＲＰｌ外显子同源性为７０．１％。鸡ＴＹＲＰｌ基冈比人ＴＹＲＰｌ基冈缺少１个内肯子：内含子中有２个微卫星序列。利用内含子１中的微卫星对家系进行基冈组扫描，卡方检验结果表明删，与皮肤色和爪色显著相关（０．０Ｉ＜Ｐ＜Ｏ．０５），和胫色极显著相关

（Ｐ＜Ｏ．０１）。用荧光原位杂交进行ＴＹＲＰｌ的染色体定位，首次将７１朋矿，定位在ｚ和ｗ染色体长臂近着丝粒的位置。

（２）在丝羽乌骨鸡、白莱航鸡、绿壳蛋鸡和寿光鸡的ＴＹＲＰＩ的７个外显子和内含子６中寻找ＳＮＰ．比较ＰＣＲ产物测序结果，只在内含子６中发现两个ＳＮＰ。经过预测，发现其中的一个ＳＮＰ可能使丝羽鸟骨鸡的内含子６中出现了新的转录冈子的结合位点。对丝羽鸟骨鸡ｎ碾Ｐ，内含子６中相对于其他３种鸡的突变序列进行的凝胶阻滞试验，证实了丝羽鸟骨鸡的ＴＹＲＰｌ在这个突变位置产生了与转录因子的结台伉点。

（３）＿ＬＩＪＲＴ－ＰＣＲ检测丝羽鸟骨鸡Ｏ．５到１６天胚胎各组织中ＴＹＲＰｌ的表达，结果表明ＴＹＲＰＩ在６大的鸡胚眼中开始表达，１０天以后开始在其它组织依次表达。ＲＴ－ＰＣＲ检测闩莱航和鸟骨鸡的８天、１６天胚胎和出生后２天各组织的ｎＲ．Ｄ』表达，结合对表型的观察发现，鸟骨鸡各组织中黑色素的沉积随ＴＹＲＰｌ的表达出现，而向柴航（除肾脏外）只在有黑色素沉积的眼睛中表达ＴＹＲＰＩ，其他组织既无ＴＹＲＰｌ的表达也无黑色素沉积。可见ＴＹＲＰｌ的表达与黑色素的沉积前１分布是一致的。

（４）以离ｚＤ摄近的ＡＣＯｌ（ａｃｏｎｉｔａｓｅ１，顺鸟头酸酶）基因为起点，设计引物筛选含ＡＣ０１的ＢＡＣ克隆，ｆ【＿Ｉｊ染色体步行的方法得到１６个ＢＡＣ克隆。通过ＢＡＣ指纹分析，构建起包含１３个克隆，覆盖了３８７ｋｂ的ＢＡＣ重叠群。通过荧光原位杂交确认了这个重叠群处于Ｚ染色体末端。

中国农业大学博｛。学位论义摘要本研究构建了中国特有鸡种丝羽鸟骨鸡基因组ＢＡＣ文库并进行了文库质鼙鉴定，它所具有的１３倍高基冈组覆盖率、６％的嵌合率和部分重叠的克隆使其成为完善鸡的基因组幽谱、研究基因功能和构建ＢＡＣ重叠群的优质资源。其次。本文对首次测定的ＴＹＲＰｌ的全基因序列和ＳＮＰ进行分析，发现丝羽岛骨鸡的ＴＹＲＰｌ具有与其它鸡种不同的微卫星标记和转录调控位点，说明ＴＹＲＰＩ的序列和ＳＮＰ造成的表达调控的变化可能与乌骨鸡独特的黑色素沉积方式有关。通过对乌骨鸡与白莱航鸡不同发育期胚胎的ＴＹＲＰＩ表达谱和对鸡胚的黑色素沉积时间和分布的观察，进一步证明了力１妒，与黑色素沉积存在密切的关系，为研究丝羽鸟骨鸡体内黑色素沉积的分子机理提出了新的假设和新的证据。最后，本文在ＩＤ基因区域进行染色体步行，构建了覆蔫３８７ｋｂ的ＢＡＣ重叠群，建立了构建染色体未知区域物理图谱的技术方法、Ｊ，ｊＩＤ基网朱来的定能和克隆打Ｆ了良好的基础。

关键词：黑色素，丝羽乌骨鸡，ＢＡＣ文库．ＴＹＲＰＩ，１Ｄ

Ａｂｓｔｒａｃｔ

Ｔｂｒｃｓｅａｒｃｈｍｅｌａｎｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｉｔｓａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ｗｅ

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Ｉ．ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＳｉｌｋｙＢＡＣｌｉｂｒａｒｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ：

（Ｉ）ＴｈｅｃｈｉｃｋｅｎＢＡＣｌｉｂｒａｒｙｃｏｎｓｉｓｔｓｏｆ１３８，２４０ＢＡＣｃｌｏｎｅｓｉｎｔｏｔａｌ（７２ｓｕｐｅｒｐｏｏｌｓ，ｅａｃｈｆｏｒ２０９６－ｗｅｌｌｐｌａｔｅｓ）．Ｔｈｅｓｔｏｒｅｄｌｉｂｒａｒｙｗａｓｏｒｇａｎｉｚｅｄｉｎｔｗｏｇｒａｄｅｓａｎｄ３－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｔａｎｄａＰＣＲｓｃｒｅｅｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍｗｉｔｈｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｗａｓｂｕｉｌｔ．

（２）Ａｖｅｒａｇｅｉｎｓｅｒｔｓｉｚｅｏｆｔｈｅｌｉｂｒａｒｙｉｓ１１８ｋｂｅｖａｌｕａｔｅｄｆｒｏｍａｎａｌｙｓｉｓｏｆ４５２ＢＡＣｓｒａｎｄｏｍｌｙｐｉｃｋｅｄｆｒｏｍｌｉｂｒａｒｙ，Ｓｏｔｈｅｇｅｎｏｍｅｃｏｖｅｒａｇｅｏｆｔｈｅｌｉｂｒａｒｙｉｓ１３．３４ａｎｄｔｈｅｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙｔｏｆｉｎｄａｓｉｎｇｌｅ—ｃｏｐｙｇｅｎｅｉｎｔｈｅｌｉｂｒａｒｙｉｓ９９．９８４％．Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｃｒｅｅｎｉｎｇｂｙ４０ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｍａｒｋｅｒｓａｎｄ８ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈｅａｖｅｒａｇｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅｍｗｅｒｅ１０．４２３ａｎｄ１１．１２５ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｎｄｍａｘｉｃｈｉｍｅｒｉｓｍｒａｔｅｉｓ６％ｅｓｔｉｍａｔｅｄｆｒｏｍＦＩＳＨｒｅｓｕｌｔｓｏｆ３２ＢＡＣｓ．ＰＦＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆ６ＥｃｏＲＩｄｉｇｅｓｔｅｄＢＡＣｓｃｌｏｎｅｓｗｈｉｃｈＷｅｒｅｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｔｈｅｌｉｂｒａｒｙａｎｄｃｏｎｔａｉｎｅｄＬＭＢＲＩｓｅｑｕｅｎｃｅｐｒｏｖｅｄｔｈｅｏｖｅｒｌａｐａｍｏｎｇｔｈｅＢＡＣｓ．

１１．ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｓｔｕｄｙｏｎＴｙＲＰｊａｎｄ／Ｄ：

（１）Ｗｅｆｉｒｓｔｓｅｑｕｅｎｃｅｄｔｈｅ１０，０６６ｂｐｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｃｈｉｃｋｅｎｒ豫Ｐ，．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔ：ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｈｕｍａｎＴＹＲＰｊ．ｃｈｉｃｋｅｎＴｙＲＰｌｉｓｓｈｏａｏｆａｎｉｎｔｒｏｎａｎｄｔｈｅｒｅｉｓｔｗｏｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓｉｎｉｎｔｒｏｎｓ．ＧｅｎｅＳｃａｎｎｉｎｇｒｅｓｕｌｔｉｎｒｅｓｏｕｒｃｅｆａｍｉｌｙｗｉｔｈｔｈｅｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｉｎｉｎｔｒｏｎｌｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔＴＹＲＰｉａｆｆｅｃｔｓｔｈｅｃｏｌｏｒｏｆｓｋｉｎａｎｄｃｌａｗｏｎａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｅｖｅｌ（０．０１＜Ｐ＜Ｏ．０５）．Ａｎｄｒ豫Ｐ』ａｆｆｅｃｔｓｌｅｇｃｏｌｏｒｏｎｅｘｔｅｍｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｅｖｅｌ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｈｉｃｋｅｎ力便Ｐ，ｅｘｏｎｓｓｈｏｗ７０．Ｉ％ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｈｕｍａｎｅｘｏｎｓＦＩＳＨｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｓｔｈａｔＴＹＲＰｌｌｏｃａｔｅｓｏｎｔｈｅｌｏｎｇａｒｍｏｆＺａｎｄＷｎｅａｒｔｏｔｈｅｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ

（２）ＷｅｓｅａｒｃｈｅｄｆｏｒＳＮＰｓｉｎ７ｅｘｅｒｔｓａｎｄｉｎｔｒｏｎ６ｏｆｒ】：ＲＰ，ｂｙＰｅＲａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｕｓｉｎｇｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｒｏｍ４ｂｒｅｅｄｓ．ＴｈｅｙａｒｅＳｉｌｋｙ，ＷｈｉｔｅＬｅｇｈｏｍ，ＢｌｕｅＳｈｅｌｌＬａｙｅｒａｎｄＳｈｏｕｇｕａｎｇ．Ｔｈｅｒｅａｒｅ２ＳＮＰｓｉｎｉｎｔｒｏｎ６．Ｏｎｅｏｆｔｈｅｍｗａｓｆｏｒｅｃａｓｔｅｄｔｏｐｒｏｄｕｃｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｉｎｉｎｔｒｏｎ６ｏｆＳｉｌｋｙＴｙＲＰｉＧｅｌ—ｓｈｉｆｔｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｉｓｍｕｔａｔｉｏｎｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｉｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅａｒｏｕｎｄｔｈｅｍｕｔａｔｅｄｓｉｔｅ．

（３）ＴＹＲＰ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏｆｒｏｍ０．５ｔｏ１６ｄａｙｂｙＲＴ－ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄ

ｔｈａｔＴＹＲＰｌｓｔａｒｔｅｄｔｏｅｘｐｒｅｓｓｉｎｅｙｅｓｏｆ６ｄａｙｅｍｂｒｙｏ．ａｎｄｔｈｅｎ

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