紫云英根瘤菌的分离与鉴定(3)

第５期管凤贞等：紫云英根瘤茵的分离与鉴定

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中下游地区广泛种植。加之其淀粉、氨基酸等含量丰富，近年来利用紫云英花粉开发出来的紫云英蜂蜜，更是以其优良的口感和良好的保健功能受到了许多消费者的青睐。

根瘤菌作为一种革兰氏阴性短杆菌，菌体感染豆科植物根后会与豆科植物共生形成根瘤。豆科植物与根瘤菌共生具有固氮能力强、固氮量大、抗逆性强的优点，是生物固氮中最高效的体系，固氮量约占生物固氮总量的６５％［１］。因此，高效根瘤菌的选育已成为豆科作物增产增效的关键。目前常用的选育方法包括自然选育心】、杂交选育口］、诱变选育‘４“］、原生质体融合选育【７３及基因工程选育［Ｂ］等，由于自然界是１个庞大的菌种资源库，因此自然选育在各种选育方法中仍处于重要的地位。虽然自然界根瘤菌资源广泛，但根瘤菌与豆科植物之间的共生结瘤是１个复杂的过程，表现出一定的专一性，只有对目标豆科作物接以合适的根瘤菌，才能促使其形成有效的根瘤以提高植株的固氮效率和产量。目前，对于根瘤菌与豆科植物匹配性能的研究主要采用水培法和琼脂试管培养法Ｌ９ｊ，２种方法各有优缺点。因此，本试验从紫云英根瘤中分离出１８株固氮菌，对各菌株菌落形态、生理生化特性、

１６Ｓ

ｒＤＮＡ等方面进行分析和鉴定，初步确定１８株菌的系统发育地位，并采用琼脂试管法和水培法将部分菌株与闽紫１号、闽紫５号、闽紫６号、闽紫７号和８４１０４４１进行配对结瘤，进而对配对结果进行对比，分析２种方法在紫云英品种与根瘤菌配对能力上的差异。

１材料与方法

Ｉ．１材料

１．１．１

１８株紫云英根瘤菌株从采自福建永泰、

闽清和浦城等地紫云英的根瘤中分离获得，分离后分别命名为ｚ１、Ｚ３、ＺＫＩ、ＺＫ７、ＺＬＨ２、２ＱＨ、ＧＺ、

ＸＺ、Ｍ３、Ｍ６、Ｍｉ０、Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、ＹＸ。

１．１．２

紫云荚闽紫ｌ号、闽紫５号、闽紫６号、

闽紫７号和８０４１０４１１由福建省农业科学院土壤肥料研究所选育。

１．１．３培养基

（１）ＹＭＡ固体培养基：甘露醇１０．０ｇ、酵母

粉０．４ｇ、ＭｇＳ０４ ７Ｈ２００．２ｇ、ＫｚＨＰ０４０．５

ｇ、

ＮａＣｌ０．２ｇ、ＣａＣ０３３．０

ｇ、琼脂１５ｇ、微量元素

液１ｍＬ、Ｈ２０

ｌ０００

ｍＬ，ｐＨ７．２。其中，微量元

素液：Ｈ３８０３２．８６ｇ、ＭｎＳｑｌ．８１ｇ、ＺｎＳ０４０．２２

ｇ，ＣｕＳＯ，０．８０ｇ、Ｈ２Ｍ００２０．０２

ｇ、加蒸馏水至

１０００ｍＬ。

（２）ＹＭＡ液体培养基：蔗糖１０．０ｇ、酵母粉

１．０

ｇ、ＭｇＳ０４ ７Ｈ２Ｏ０．２ｇ、Ｋ２ＨＰ０４０．５

ｇ、

ＮａＣｌ０．１

ｇ、ＣａＣｌ２０．０５

ｇ、Ｒｈ微量元素液４．０

ｍＬ、Ｈ，Ｏ１０００ｍＬ，ｐＨ６．８～７．０。

（３）琼脂试管法培养基：Ｋ。ＨＰＯ。０．１３６

ｇ、ＭｎＳＯ。１．８１０ｇ、ＫＣｌ０．０７５ｇ，ＺｎＳ０４０．２２０

ｇ、

ＭｇＳＯ＿‘ ７Ｈ２００．０６０ｇ、Ｈ３ＢＯ。２．８６０ｇ、ＣａＳ０４

０．４６０

ｇ、ＣｕＳ０４ ５Ｈ２００．８００ｇ、Ｈ２Ｍ００２０．０２０

ｇ、Ｃａ（Ｎ０３）２０．０３０

ｇ、柠檬酸铁０．０７５ｇ、琼脂

８～１０

ｇ。

（４）水培法培养基：ＫＨ２ＰＯ，２．２ｇ、ＭｎＳ０４ Ｈ２０

１００．０ｍｇ、ＫＣＩ１５．５ｇ、ＺｎＳ０４ ７Ｈ２０２５．０ｍｇ、

ＭｇＳ０４ ７Ｈ２０２５．０ｇ、Ｈ３Ｂ（１２５．０ｒａｇ、ＣａＣＩｚ ２Ｈ２０

２１．５ｇ、ＣｕＳＯ， ５Ｈ。Ｏ２５．０ｍｇ、Ｎａ：ＭｏＯ， ２Ｈ２０５．０ｍｇ、ＮａＮ０３３．０

ｇ、柠檬酸铁３．０

ｇ。

１．１．４主要仪器设备ＰＣＲ仪、水浴锅、电泳仪、凝胶成像系统、三角瓶、１．８

ｃｍＸｌ８ｃｍ滤纸

条、试管架、镊子、烧杯、带滤纸的灭菌培养皿、不带滤纸的灭菌培养皿、聚乙烯薄膜、光照培养箱、超净工作台等。

１．２方法

１．２．１紫云英根瘤茵的分骞从福建永泰、闽

清、浦城等地获得的紫云英中选取生长状态良好的植株，取其根部肥大、饱满、粉红色的根瘤，用水冲洗去泥，然后用无菌水反复冲洗，滤纸吸干，再用７５％乙醇浸泡２ｒａｉｎ，０．１％氯化汞浸泡２～５ｒａｉｎ。无菌水冲洗５～６次，于无菌条件下，用镊子将根瘤压碎。将挤出液接种到斜面试管内，２８℃培养，长出菌落之后，进行平板稀释分离，将单菌落接到斜面上。重复进行稀释分离，获得单菌落接种到斜面上保存口］。

１．２．２根瘤茵的细茵学鉴定

（１）形态学鉴定：参照根瘤菌常规鉴定方法［１０－１２］进行革兰氏染色及对菌落特征进行描述。

（２）生理生化试验：ＹＭＡ刚果红反应、牛肉膏一蛋白胨反应、ＢＴＢ反应、石蕊牛奶反应、３一酮基乳糖反应、柠檬酸盐反应。

１．２．３茵株１６ＳｒＤＮＡ的测定

根瘤菌ＤＮＡ提

取参照文献［１３］方法进行。ＰＣＲ扩增扩增体系

２５肛Ｌ：ｌＯ×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２．５ｐＬ、ｄＮＴＰ２．５肛Ｌ、

模板ＤＮＡ

１．０弘Ｌ、Ｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１０．５弘Ｌ、

Ｓｅｒｉｎｅ

ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２

０．５“Ｌ、ｒＴａｑ酶０．２５ｔ．ｔＬ、

ｄｄＨ２０１７．７５“Ｌ。

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