第六章 微生物的生长与环境条件

第六章 微生物的生长与环境条件

微生物的生长与环境条件的关系极为密切。只有当外界供给适当营养物质，满足微生物对各种物理、化学因子的要求之后，微生物才能正常生长，而不良的环境条件则导致微生物停止生长，变异或死亡。

在高等动植物中，生长和繁殖是两个完全不同而且易于区分的概念。在适宜的环境条件下，生物个体的增大谓之生长，而个体数量的增加谓之繁殖。

线状微生物（如真菌）的生长表现为菌丝体的分枝和伸长。繁殖表现为产生孢子，孢子脱离母体菌丝后，再萌发产生子代菌丝体。

单细胞微生物也有个体生长和细胞分裂繁殖这两个过程。细胞的体积逐渐增大，这就是生长。个体数目增加，这就是繁殖。但在实际工作中，由于研究单个微生物（如细菌、古菌）细胞的生长既十分困难又无必要。因此，微生物的生长主要是指微生物群体中个体数量或质量的增长，它实际上包括了生长和繁殖这两个既有联系又互相区别的概念。单细胞微生物生长是通过繁殖而表现出来的，以群体数目的增加为标志。

第一节、微生物的生长和测定方法

（一）、微生物生长的定义

微生物生长是与细胞内生理代谢活性紧密联系的，有人估计，细菌细胞生长的合成过程大约包含了 2000 多个各种化学反应。因此，代谢活性也可以作为衡量微生物生长情况的一个指标。生长的概念应是在合适的外界环境条件下，微生物个体或群体细胞中主要化学组分的协调而平衡的增长。也就是说，微生物在生长过程中应保持恒定的细胞化学组成，细胞内的 DNA 、蛋白质、多糖和类脂等主要成分应协调增长；生长的外部表现为个体数量的增加和群体生物量（biomass）的增长。生物量是指一种生物单位体积的重量，多以克为单位。

（二）、微生物生长的测定方法

1、细胞总数的测定

测定液体培养基中细菌总数，包括活的和已丧失生活能力的细菌。

（1）显微镜直接计数法 本法仅适用于细菌等单细胞的微生物类群。测定时需用细菌计数器（Petroff-Hausser counter，适用于细菌）或血球计数板（适用于酵母、真菌孢子等）。在普通光学显微镜或相差显微镜下，直接观察并记下一定体积中的平均细胞数，然后换算出供测样品的细胞数。

本法的优点是快捷简便、容易操作；

缺点是不能区分死活细胞，以及形状与微生物相似的颗粒性杂质。 （2）比浊法 这是测定菌悬液中细胞总数的快速方法。原理是菌悬液中细胞数量越多，浊度越大，在一定浓度范围内，悬液中的细菌细胞浓度与光密度（OD值）成正比，同透光度成反比。

由于细菌细胞浓度仅在一定范围内与光密度成直线关系，因此待测菌悬液细胞浓度不宜过低或过高。培养液的颜色不宜过深，因颗粒性杂质也会干扰测定结果。本法常用于跟踪观察培养过程中细菌数目的生长情况，如细菌生长曲线的测定和工业生产上发酵罐中的细菌生长情况等。

2、活细菌数量的测定 此法是测定具有繁殖能力的细菌数量。

（1）稀释平皿测数法 在理论上可以认为，在高度稀释条件下，微生物细胞充分分散，呈单个细胞存在。每一个活的单细胞均能繁殖形成一个菌落，因而可以用平皿培养的方法使每个活细胞生长并形成一个单独的菌落，通过统计长出的菌落数来推算待测样品中的活菌数。具体做法像稀释平皿分离法一样，先将待测样品作一系列倍比稀释，将定量的稀释液接种于琼脂培养基，作平皿培养。根据平皿上出现的菌落数，便可推算出待测样品中活菌数方法是迄今仍广泛采用的主要活菌计数方法之一。缺点是由于供试培养基和实验条件的限制，在混合微生物样品中，并非所有细菌都能形成肉眼可见的菌落。而且在实际操作中难以做到使所有细胞完全分开，不能保证每个菌落都是由单个细胞分裂而来，所以现在倾向于用菌落形成单位（colony forming units, CFU）表示样品中活细菌数量。本法又分为倾注平板法（pour plate method）和涂布平板法（spread plate method）两种。

（2）最大概率法（most probable number, MPN） 将待测样品在定量培养液中作一系列稀释培养。在一定稀释度数以前的培养液中出现细菌生长，而在这个稀释度以后的培养液中不出现细菌生长。将最后3级有菌生长的稀释度称为临界级数，以3~5次重复的3个临界级数求得最大概率数（MPN），可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。

稀释度 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 重复数 5 5 5 5 5 5 出现生长的管数 5 5 5 4 1 0

根据上述结果，其数量指标为“541”，查统计分配表（表8-1），得到近似值为17。乘以第一位数的稀释倍数105，则原菌液中的活菌数=17x105。即每毫升原菌液中含活菌数1.7x106个。本方法特别适合于含菌量少的样品或一些在固体培养基上不易生长的细菌样品的测数，特点是利用微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类微生物的存在和丰度。如测定土壤微生物中特定生理群（如能进行氨化、硝化、纤维素分解、自生固氮、根瘤菌、硫化和反硫化细菌等）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生和类群的细菌数量。其缺点是只能进行特殊生理群的测定，结果也较粗放。

（3）浓缩法（滤膜法） 对于测定象空气、水等体积大而且含菌浓度较低的样品中的活菌数，富集，培养，最后可根据菌落数推算出样品的含菌数。

3、细胞生物量的测定 主要有4种方法。

（1）测定细胞干重法 将单位体积的液体培养基中培养的微生物，经过滤或离心收集菌体细胞，用水洗净附在细胞表面的残留培养基。在105℃高温或真空下干燥至恒重，称重，即可求得培养物中的总生物量。一般细菌干重约为湿重的20%，本法适用于含菌量高、不含或少含颗粒性杂质的样品。一般每1mg细菌干重约等于4~5mg湿菌鲜重和相当于4~5×109个细胞。

（2）DNA含量测定法 微生物细胞的DNA含量较为恒定，不易受菌龄和环境因素的影响。DNA可与DABA-HCl（3，5-二氨基苯甲酸-盐酸）溶液反应，显示特殊的荧光，根据这种荧光反应强度求得DNA含量。它可以反映待测样品中所含的生物量，也可以根据DNA含量计算出细菌数量。有人推算，平均每个细菌细胞约含8.4x10-5ng DNA。该法的优点是结果准确，缺点是比较费时费事

（3）ATP含量测定法 微生物细胞中都含有相对恒定量的ATP，而ATP与生物量之间有一定的比例关系。用适当的试剂从培养物中提取出ATP，以分光光度计测定它的荧光素-荧光素酶反应的强度，经换算即可求得生物量。此法灵敏度高，但受培养基中含磷量的影响。

（4）代谢活性法 该法是通过测定生活细胞的代谢活性强度来估算其生物量。如测定

单位体积培养物在单位时间内消耗的营养物或氧气的数量，或者测定微生物代谢过程中的产酸量或产二氧化碳量等，均可在一定程度上反映微生物的生物量。对于丝状微生物来说，还可以通过测定在一定生长条件下和一定时间内菌丝伸展的长度或菌落的大小，来表明它们的一般生长情况。本法是间接法，影响因素较多，特别是由于并非所有的代谢指标都与生物量之间有比例关系，所以误差较大，仅适合在特定条件下作比较分析时使用。

（5）总氮量测定法 细胞干重的含氮量一般为12~15%

三、细菌的群体生长——生长曲线

在适宜条件下，大多数细菌的繁殖速度都很快。大肠杆菌在合适的条件下，每20min可分裂一次。如果始终保持这样的速度，在48h内从一个大肠杆菌细胞开始连续分裂，其子代细胞可达2.2x1043个，质量可达2.2x1025吨，约为地球质量的3680倍。显然，，这种情况决不会发生，细菌在一个容积有限的环境中不可能无限制地高速生长。

研究细菌群体生长的传统方法是分批培养法（batch culture），这种方法是将少量细菌接种到一定体积的液体培养基中，让其自然生长直到养分耗尽，并随时测定细菌数目，可以发现细菌的群体生长有一定的规律。若以时间为横坐标，活菌数的对数为纵坐标，可以绘制一条类似于S形的曲线，这就是细菌的生长曲线。可以把细菌的群体生长分为四个时期：各个时期的长短取决于菌种特性和培养条件。

延缓期（lag phase） 或称延滞期。接种到新鲜培养液中的细菌细胞往往需要

一段时间来进行调整，以逐渐适应新的环境，这个时期内的细菌细胞的体积增长较快，，贮藏物质消失，DNA含量提高，产生各种诱导酶。因此，虽然在延缓期内细胞不分裂，但不能认为这个时期的细胞代谢不活跃。事实上，细胞在为分裂进行着生理上的准备。在这个时期的后段，少数菌体开始分裂，曲线稍有上升。

延缓期的长短，因菌种和培养条件不同而异，自几分钟到数小时不等。如将处于对数期的细菌接种到相同的培养环境中，可缩短甚至消除延缓期。

工业发酵中可通过手段改善和缩短这个时期:1遗传改造2利用对数生长气的细胞作为种子3 培养基组分不要差别太大4 扩大接种量

指数期（exponential phase） 或称对数期。在这个时期中，细胞的代谢

活性最强，细菌旺盛生长，每分裂一次所间隔的时间最短，单位时间内细胞数量成倍增加。在生长曲线上，表现为一条上升的直线。

细菌在指数期每分裂一次所需的时间称为世代时间，用G表示。假设细菌在对数期开始时有N0个细胞，由于细菌进行二分分裂，所以经过n个世代后，细胞的数目Nt应为：

Nt=N0×2n

以对数表示：lgNt=lgN0+nlg2

则： n=lgNt-lgN0/lg2=3.3(lgNt-lgN0) 设t为细胞分裂n代所需的总时间，则有

G=t/n=t/[3.3(lgNt-lgN0)]=0.301t/lgNt-lgN0 式中n=繁殖世代数

N0=对数期开始时细菌数 Nt=对数期t时细菌数 G=世代时间

通过实验，可以测得Nt、N0和时间（t）。由此可计算出供试细菌的世代时间（G）。微生物的世代时间取决于它自身的遗传特性，还受到温度、pH、养料和通气等环境因子的影

响。

处于对数期的细菌，生长迅速，形态、生理和化学组成的特性较为一致，是较为理想的研究材料。由于旺盛生长的细胞对环境等因子的作用敏感，因而也是研究遗传变异的好材料。

稳定期（stationary phase） 或称最高稳定生长期。细菌经过对数期的旺盛

生长后，其周围环境发生了一系列变化。某些营养物质的开始缺乏，代谢产物的累积，pH和Eh的变化等限制了菌体细胞继续高速度地生长和分裂，使细菌的繁殖速率下降，而死亡率逐渐上升。细菌的老细胞死亡数与新细胞的增长数接近于平衡状态，生长转入稳定期。

在这一时期内，细菌群体的活菌总数达到最高，并可相对持续一定时间。细胞开始积累贮存物质，如糖原、异染颗粒等；大多数产芽胞细胞形成芽胞；有些菌则在稳定期内合成次生代谢产物。细菌处于稳定期的长短与菌种特性和环境条件有关，在发酵工业中，为了获得更多的菌体或代谢产物，还可以通过补料，调节pH、温度或通气量等措施来延长稳定期。

衰亡期（death phase） 或称衰老期。继稳定期后，环境变得更不适于细菌

生长，细胞的生活力继续衰退，其死亡率逐渐增高，活菌数急剧减少，表现为曲线下降。这个时期的细胞呈多形态，有时产生畸形细胞，而且细胞质内多液泡。其革兰氏染色性亦不

－

稳定，有些G+细菌染色反应变为G。

三、二次生长、同步生长和连续培养 1. 二次生长 (diauxic growth)

当培养液中两种能为微生物利用的营养物质同时存在时，微生物首先利用其中较易利用的营养, 进入稳定期后, 微生物经过短暂适应后，开始利用第二种营养物再次开始新的对数生长，并进入新的稳定期，表现为二阶式的双峰生长曲线。

因为微生物利用葡萄糖的酶系式固有的，而利用第二种糖如阿拉伯糖或乳糖的酶系式诱导合成的。在有葡萄糖存在时，细胞内的cAMP水平低，阻遏了利用第二种糖的酶系的合成。由于合成新酶系需要一定的时间，所以在二次生长之间出现了一段延缓期。

2.同步生长(synchronized growth)

通过严格控制培养条件，使群体细胞中每个细胞在生活周期中都处于相同的生长阶段。 相同的时间分裂，彼此间形态结构、生理生化特征基本一致。 适于细胞学等研究。

获得同步培养细胞的途径→膜洗脱法和密度梯度离心法 3.连续培养(continuous-flow culture)

是在一个恒定容积的流动系统中培养微生物，通过不断供给新鲜营养物质，排除陈菌液，使培养的微生物维持相对较长时间的对数生长期，以利于提供较多的对数生长期细胞，这种培养方法称为连续培养。

四、环境条件对微生物生长的影响

微生物的生长离不开环境，其生长是微生物与外界环境因子共同作用的结果。一般来说，只有当外界环境条件适宜时，微生物才能进行正常的生长、繁殖。在外界环境不适宜时，微生物的生命活动就受到抑制或引起变异，甚至死亡。本节将介绍一些物理、化学环境因子对微生物生长的影响。通过对这些环境因子的作用进行分析，不仅有助于掌握微生物的生长

繁殖规律，而且对生产实践也有指导意义。同时也必须明确，不同微生物对各种理化因子的敏感性不同，应注意区别对待。

（一）温度

温度是微生物生长的诸多重要环境因素之一。从微生物总体来看，生长的温度范围很广，可在-12~100℃或更高生长，但具体到某一种微生物，则只能在更为有限的温度范围内生长。也就是说，不同微生物对温度的要求不同。各种微生物都有其生长繁殖的最低温度、最高温度和最适温度。

最低温度是指微生物能生长的温度下限。在此温度范围内，微生物尚能生长，但生长速度非常缓慢。除反复冻融等处理外(使微生物细胞内的游离水形成冰的晶体，造成细胞脱水，并且冰晶体对细胞还有机械损伤作用，也会导致其死亡)，低温一般不易导致微生物的死亡。微生物可以在低温下较长期地保持其生活能力，因此，我们也才有可能采用低温来保藏微生物。采用快速冷冻和在细胞悬液中加入甘油等保护剂，以保护细胞。

最高温度是指微生物能生长的温度上限。在此温度下，微生物仍能生长，而超过这个温度时，微生物就停止生长或死亡。超过微生物生长的最高温度可引起微生物细胞内的蛋白质凝固，使酶变性失活，代谢停滞而死亡。通常我们把能在10min内杀死某种微生物的高温界限称为致死温度，而在某一温度下杀死细胞所需的最短时间称为致死时间。D值：食品工业中常用，指在特定温度下，使微生物活菌数减少10倍所需要的时间。

微生物对热的忍受力差别很大,可以利用高温对微生物的影响，进行灭菌，分为干热灭菌（160~170℃，2hr）、高压蒸汽灭菌(121℃,15~20min)、间歇灭菌。采用干热灭菌法可杀死培养皿等各种器皿中的全部微生物，干热灭菌条件是160~170℃、1~2h。在同一温度下，湿热灭菌法比干热灭菌法的效果好，这是由于湿热灭菌法主要是通过热蒸汽杀死微生物，蒸汽的穿透力较热空气强，而且蛋白质含水量愈高，愈易于凝固。所以，在同一温度下，湿热比干热更容易引起微生物死亡。

最适合生长的温度称为最适温度。在这个温度下，微生物迅速生长。值得指出的是，最适温度不一定是微生物代谢的最适温度，例如，青霉素产生菌产黄青霉（Penicillium chrysogenum）虽然在30℃时生长最快，而青霉素产生的最适温度却在20~25℃范围内。因此，在青霉素生产过程中应采用各阶段变温培养的方法以提高产量。前期为菌丝体生长阶段，温度应保持在30℃，而后期为抗生素产生阶段，温度最好保持在20~25℃范围内。 1、微生物生长的温度类型

根据不同微生物对温度的要求和适应能力，可以把它们区分为低温、中温和高温3种不同的类型，各类微生物对温度的适应范围和分布见表8-4和图8-14。

表8-4 微生物的生长温度类型 微 生 物 类 型 低温型 中温型 专性嗜冷 兼性嗜冷 室温 体温 生长温度范围（℃） 最 低 -12 -5~0 10~20 最 适 5~15 10~20 20~35 35~40 最 高 15~20 25~30 40~45 分布的主要处所 两 极 地 区 海水及冷藏食品上 土壤、水、空气、动植物 人和温血动物

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