微生物检验方法验证方案

微生物限度检查方法（平皿法）

验证方案

目 录

一、 验证方案的制定

二、 验证方案的起草与审批

三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案

1．验证目的和原理

2．验证方法步骤

3．试验实施

3.1试验前的准备

3.2验证试验操作

3.3试验结果

4．验证结果评价分析

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5．附件

微生物限度检查方法（平皿法）验证文件

一、 验证方案的制定 验证项目名称 编号 验证小组组员 成员职务 组长 副组长 组员 姓名 步骤 验证方案组织实施进度 二、 验证方案的起草与审批 1验证方案的起草 验证项目名称 编号 微生物限度检查方法（平皿法）验证 VF-PR-17-A 第 2 页 共 14 页 主要工作职责 方案设计责任人 方案实施负责人 操作人 操作人 操作人 操作人 实施日期 微生物限度检查方法（平皿法）验证 VF-PR-17-A

起草部门 生产部 质控部

2．验证方案的审核与批准

起草人签名 日期 年 月 日 年 月 日 验证方案审核人： 审核日期： 年 月 日 验证方案批准人： 批准日期： 年 月 日 三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案 1．验证目的和原理 1.1 验证目的

为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。 1.2 原理

通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。 2．验证方法步骤

2.1验证前的准备 进行微生物限度检查方法（平皿法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。试验菌应包括G-、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。

2.2验证试验的操作计划 用3个不同批号产品按照微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断微生物限度检查方法是否对产品有影响。 2.3试验结果可接受标准 用标准菌株评价方法“尿素维生素E乳膏的微生物限度检查”对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组的回收率也不低于70%。 3．试验实施 3.1试验前的准备

3.1.1主要仪器设备：高压蒸汽灭菌器、恒温烘干箱、净化工作台、生物安全柜、

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恒温培养箱、霉菌培养箱。

3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层流装置。环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或防置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。

3.1.3试验样品： 尿素维生素E乳膏：

批号 批号 批号

3.1.4稀释液和试剂： PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 无菌十四烷酸异丙酯 3.1.5器具 无菌培养皿：（直径90mm） 无菌移液管（5ml） 3.1.6验证用微生物名称及其编号

实验菌株的来源： 菌株名称 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成 3.1.7培养基

名称 营养琼脂 培养基 改良马丁琼 脂培养基 3.2验证试验操作 3.2.1试验菌的制备和稀释

将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在30～35℃下培养18～24小时，将白色念珠菌接种至良马丁流体培养基中，23～28℃下培养24～48小时。将黑曲霉接种至改良马丁琼脂培养基中，在23～28℃下培养5～7天小时。将上述培养物用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含

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生产商 培养基批号 配制日期 有效期 内控编号

菌落数为50～100cfu的菌悬液。

3.2.2用不同类别的微生物考察供试液及检验程序的抑菌性，将试验分为4组

A样品试验组 准确取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：10的供试液。 用移液管准确吸取1.0ml供试液至平皿中；并在每个平皿中接种50～100cfu试验菌，立即倾注营养琼脂培养基，每个试验菌平行接种2个平皿，按照 平皿法测定其菌数。

B菌液组 在平皿中注入1ml的菌液立即倾注营养琼脂培养基，以测定所加的菌数。

C供试品对照组 取规定量的供试液，按菌落计数方法测定供试品的本底菌数。

D 稀释剂对照组 取相应稀释液1ml加入试验菌，使最终菌浓度为每ml供试液含50～100cfu试验菌，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌落数。

3.2.3培养 将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在30～50℃下培养48小时将白色念珠菌、黑曲霉在23～28℃下培养72小时，点计菌落数。并将结果记录于附件1。 3.3试验结果

3.3.1稀释剂对照组菌的回收率 接入菌种 大肠埃希菌 平均值 金黄色葡萄球 平均值 第 5 页 共 14 页

尿素维生素E乳膏批号 菌落计数（cfu/皿） 稀释剂对照组 菌液组 回收率

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