生物技术专业大实验实验指导 (7)

实验十一 细胞工程基础实验技术

一、实验目的

学会并掌握微藻培养基的配置方法；植物细胞培养基MS的配制；动物细胞RPMI1640培养基的配制，各种附加成分母液的配制；灭菌方法。 二、实验内容

常用植物细胞培养基MS母液的配制以动物细胞培养中各种附加成分母液的配制；培养基的配制；灭菌。

三、实验要求

集中授课

四、实验准备

在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。

五、实验原理、方法和手段

每种微藻都有最适宜的培养基，但海水藻以f/2为一般培养基，淡水藻以朱氏10号或BG11为一般培养基，若培养螺旋藻采用AB培养基。无论哪种培养基由于试验的需要，常常要求在短期时间内获得大量的培养物，所以在微藻允许范围内富集大量营养元素，加速藻的生长。

植物培养基中含有外植体生长所需的营养物质，是组织培养中外植体赖以生存和发展的基地。培养基的成分大致可分五类即水、无机营养、有机营养、植物生长物质和天然附加物。MS(Murashige和Skoog,1962)培养基含有较高的硝态氮和铵态氮，适合于多种培养物的生长。此外还有N6、B5培养基等。应根据培养的目的选择一种适宜的培养基。本实验制备MS培养基。 动物细胞培养中培养基培养基为RPMI1640，主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些辅助物质。胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)或盐溶液，是细胞培养中常用的基本液体。它主要由无机盐和葡萄糖配制而成，起着维持渗透压、缓冲和调节酸碱度等重要作用。

六、实验条件

（一） 仪器 1. 高压灭菌锅 2. 电磁炉

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3. 纯水仪 4. 电子天平 （二） 材料 微藻培养所需 1. KCl 2. KBr 3. NaF 4. SrCl2·6H2O 5. H3BO3 6. MgCl2·6H2O 7. Na2SO4 8. NaHCO3 9. CaCl2 10. NaCl 11. NaNO3

12. NaH2PO4 13. Na2SiO3·9H2O 14. FeC6H5O7·5H2O 15. ZnSO4·4H2O 16. MnCl2·4H2O 17. CoCl2·6H2O 18. Na2EDTA 19. CuSO4·5H2O 20. Na2MoO4·2H2O 21. VB12

22. VB1等 植物愈伤组织传代所需1. 萘乙酸 2. 苄基氨基嘌呤 3. 硝酸铵

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4. 硝酸钾 5. 氯化钾 6. 硫酸镁 7. 磷酸二氢钾 8. 碘化钾 9. 硼酸 10. 硫酸锰 11. 硫酸锌 12. 钼酸钠 13. 氯化钴 14. 硫酸铜 15. 硫酸亚铁 16. 乙二胺四乙酸二钠 17. 甘氨酸 18. 烟酸 19. 盐酸吡多醇 20. 盐酸硫胺素 21. 肌醇 22. 蔗糖 23. 琼脂

24. 三角瓶（50 mL）

25. 棕色瓶（100 mL ，500mL，1000 mL） 26. 镊子

27. 玻璃烧杯（100 mL ，500mL，1000 mL）28. 玻璃棒 29. 棉塞或封口膜 30. 记号笔 肿瘤细胞传代所需 1. RPMI-1640培养基 2. 胎牛血清

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3. NaCl 4. KCl

5. Na2HPO4?H2O 6. KH2PO4 7. CaCl2 8. MgSO4?7H2O 9. 葡萄糖 10. 胰酶 11. EDTA 12. 三蒸水 （三） 试剂 微藻培养所需 1人工海水配方

KCl 0.664 g/L； KBr 0.096 g/L； NaF 0.003 g/L； SrCl2·6H2O 0.024 g/L； H3BO3 0.026 g/L； MgCl2·6H2O 4.981 g/L； Na2SO4 3.917 g/L； NaHCO3 0.192 g/L； CaCl2 1.102 g/L； NaCl 23.476 g/L； 2 f /2培养液的配方

（1）NaNO3 74.8 mg/L； （2）NaH2PO4 4.4 mg/L； （3）Na2SiO3·9H2O 11 mg/L； （4）FeC6H5O7·5H2O 3.9mg/L （5）微量元素母液配方 1000?

ZnSO4·4H2O 23 mg/L；

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MnCl2·4H2O 178 mg/L； CoCl2·6H2O 12 mg/L； Na2EDTA 4.35 g/L； CuSO4·5H2O 10 mg/L； Na2MoO4·2H2O 7.3 mg/L （6）维生素母液配方 1000?

VB12 0.5 mg/L； VB1 100 mg/L 3朱氏10号培养基配方：

Ca (NO3)2 0.04 g； K2HPO4 0.04 g； MgSO4·7H2O 0.025 g； Na2CO3 0.02 g； Na2SiO3 0.025 g； FeCl3 0.0008 g； H2O 1000 ml；

培养基中的三价铁离子用量极少，为保证用量，将其配制成100倍的母液。由于实验室中的FeCl3 含有结晶水，所以称量0.13g的FeCl3·6H2O用100 ml蒸馏水溶解即为母液，每1000 ml培养基中加入1ml。

4AB培养基，其配方成分如下表所示

AB 培养基配方（L）

Working solution:

glass–distilled water 993ml

NaHCO3 13.61g Na2CO3 4.03g KH2PO4 0.5g NaNO3 2.5g K2SO4 1g NaCl 1g

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