生物技术专业大实验实验指导

《 生物技术专业大实验 》课程

课程编号：0741524966

实 验 指 导 书

主撰人 韩军丽 王雪青 金玉莲 赵培 审核人 王素英

天津商业大学 生物技术与食品科学学院

二零零九 年 十一月

前 言

1． 实验总体目标 使学生掌握基因工程、分子生物学、细胞生物学及细胞工程实验技术，

提高学生实验动手能力、以及在实验中分析问题和解决问题的能力，为今后从事生物技术相关工作和研究打下坚实的基础。

⒉ 适用专业年级 生物技术专业第6学期

⒊ 先修课程 生物化学、微生物学、遗传学、细胞与分子生物学、基因工程、细胞工程 ⒋ 实验课时分配

实验项目 实验一 目的基因的PCR扩增 实验二 DNA片段的回收 实验三 DNA的连接 实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备 实验五 重组DNA的转化 实验六 快速分离大肠杆菌中的重组质粒 实验七 重组质粒的酶切鉴定 实验八 外源基因诱导表达及蛋白质检测 实验九 细胞凝集反应 实验十 细胞膜的渗透性 实验十一 细胞工程基础实验技术 实验十二 无菌操作及愈伤组织诱导技术 实验十三 微藻规模化培养 实验实验每组实验 要求 类型 人数 学时 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 4 4 2 3 3 3 4 12 2 2 4 4 4

⒌ 实验环境 生物技术专业实验室 ⒍ 实验总体要求

进入实验室，必须穿实验服。保持实验台的整洁，自己的物品需放置在指定位置，贵重物品随身携带。

⒎ 本实验的重点、难点及教学方法建议

本专业大实验主要包括基因克隆、克隆的鉴定、细胞生物学基本实验以及细胞工程基本实验技术。

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目 录

实验一 目的基因的PCR扩增 实验二 DNA片段的回收 实验三 DNA的连接

实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备 实验五 重组DNA的转化

实验六 快速分离大肠杆菌中的重组质粒 实验七 重组质粒的酶切鉴定

实验八 外源基因诱导表达及蛋白质检测 实验九 细胞凝集反应 实验十 细胞膜的渗透性 实验十一 细胞工程基础实验技术 实验十二 无菌操作及愈伤组织诱导技术 实验十三 微藻规模化培养

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实验一 目的基因的PCR扩增

一、实验目的

目的基因的分离技术是基因工程的三大核心技术之一。应用PCR技术分离目的基因是常用的方法之一。通过本实验的学习，要求学生掌握PCR技术的基本原理；掌握用PCR技术扩增目的基因的方法。 二、实验内容

设计特异引物，以含有目的基因的质粒DNA为模板，用PCR方法扩增目的基因。

三、实验要求

集中授课

四、实验准备

在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。

五、实验原理、方法和手段

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 PCR反应体系包括五种成分：（1）模板DNA；（2）引物；（3）四种脱氧核糖核苷酸；（4）DNA聚合酶；（5）反应缓冲液（提供Mg2+、pH、离子强度）。PCR反应的基本步骤包括：（1）变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃）；（2）退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃）；（3）延伸：DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃）。 PCR反应体系的总体积一般为25μl～100 μl 。

为了提高PCR的扩增效率，PCR反应体系中各成分的浓度按如下原则调控：

（一）反应缓冲液：由纯水、KCl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。KCl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。 Mg2+终浓度为1.5～2.0 mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。Mg2+能影响反应的特异性和产率。

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（二）BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。

（三）dNTPs：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为 10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。

（五）Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。用量一般为0.5～5个单位/100μl。

（六）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。 模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。

（七）引物：引物浓度一般为0.1～0.5 μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。 引物G C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。

为了提高PCR的扩增效率，PCR反应温度以及温度持续时间按如下原则确定：

（一）变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）预变性3～10min，然后再进入循环程序94℃变性30～60s。

（二）退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G C)×4℃ (A T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(G C)低于50%，退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。

（三）延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min即可。

PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，一般20～30次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预实验确定。

六、实验条件

1. 生物材料和试剂

质粒DNA，引物，Taq DNA聚合酶，10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液，dNTPs，ddH2O

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