乙醇脱氢酶Ⅰ类基因全长cDNA的克隆与表达

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乙醇脱氢酶 类基因全长cDNA的克隆与表达

周文婷1，崔羽，王晓燕2，张永红，李世荣，李景鹏*

（东北农业大学生命科学与生物技术中心，哈尔滨 1500301；

哈尔滨医科大学附属第四医院检验科，哈尔滨 1500012）

摘 要： 类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中发挥重要作用，由ADH1、ADH2和ADH3组成。根据序列数据设计一对引物，利用RT-PCR同时克隆乙醇脱氢酶 类基因全长cDNA。测序后的cDNA被克隆在表达载体pTYB11上并在大肠杆菌中稳定表达。纯化获得的酶通过检测其在340nm处吸光值的变化进行酶活性测定。经检测重组ADH1，ADH2和ADH3的酶活力分别为1.8± 0.3U/mg, 0.9±0.2U/mg和1.4±0.2U/mg。

关键词：乙醇脱氢酶（ADH）；基因克隆，原核表达；酶活力检测1

酒是重要的消费品。现已知乙醇及其代谢产物是包括癌症在内的许多疾病的重要诱因。乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）是催化乙醇代谢初始反应的重要酶[1]。根据酶学及DNA/蛋白质序列上的差异，人类ADH被分为五类[2]，其中Ⅰ类ADH由ADH1、ADH2和ADH3组成，在乙醇代谢中发挥主要作用[3]。现已发现ADH2和ADH3位点均存在基因多态性，从而使所编码酶在乙醇代谢过程中表现不同的催化速率。一般认为编码高活性乙醇脱氢酶的等位基因ADH2*2和ADH3*1能够降低东亚人乙醇相关疾病的患病风险。

乙醇脱氢酶Ⅰ类基因的克隆已有很长时间[4]，然而国内尚无此类报道。由于该类基因的获得是深入进行其分子组成分析及结构研究的基础，本文中，我们以一对引物同时克隆该类基因，并在大肠杆菌中获得稳定表达。经检测，获得的重组酶具有较高的生物活性。

1. 材料与方法

1.1 材料与试剂

五月龄流产胎儿新鲜肝、肾组织，切小块液氮中急速冷冻，-80℃保存。E.coli ER2566、表达载体pTYB11及IMPACT -CN蛋白纯化系统购自NEB公司。限制性内切酶购自Takara。pGEM-T载体系统及M-MuLV 逆转录酶购自Promega。TRIzol试剂及NAD+氧化性辅酶Ⅰ购自Gibco。酵母醇脱氢酶标准酶制剂购自Sigma。

1.2 Ⅰ类乙醇脱氢酶基因cDNA的克隆及pGEM-T-ADH重组质粒的鉴定

按Trizol试剂说明书提取肝、肾总RNA。因该类基因具有约95%同源性，根据GenBank发布的该类基因多个mRNA序列同源区设计引物PⅠ 5’GAATTCATGAGCACA GCAG 3’ 和PⅡ ，各自带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点。按说明书*电子信箱：E-mail:ljingpeng@

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