乙醇脱氢酶Ⅰ类基因全长cDNA的克隆与表达(2)

?类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中发挥重要作用,由ADH1、ADH2和ADH3组成。根据序列数据设计一对引物,利用RT-PCR同时克隆乙醇脱氢酶?类基因全长cDNA。测序后的cDNA被克隆在表达载体pTYB11上并在大肠杆菌中稳定表达。纯化获得的酶通过检测其在340nm处吸光值的变化进行酶活性

进行RT-PCR扩增，获得的cDNA与pGEM-T载体分别连接，重组质粒经EcoRⅠ /XhoⅠ双酶切初步鉴定。比较三个基因的限制性内切酶图谱发现，1-375范围内，ADH1在第171碱基处有一个KpnⅠ酶切位点，ADH3在第133碱基处有一个PstⅠ酶切位点，而ADH2在这两个位置无酶切位点。据此，设计引物PⅢ 5’CAATATGAGCACAGCAGGAAA 3’和PⅣ

5’CCACACTGAGGAGTAAAGAGC 3’进行PCR扩增并对扩增产物分别进行PstⅠ和KpnⅠ单酶切，对鉴定的重组子测序并对测序结果进行分析、比较。

1.3 ADH1-3基因cDNA的表达与纯化

重组载体pGEM-T-ADH与表达载体pTYB11分别经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切，获得的cDNA与表达载体连接后转化大肠杆菌ER2566，对含重组表达质粒的阳性菌进行双酶切鉴定。

在LB培养基(含100µg/ml Amp)中分别培养阳性菌及对照菌。培养物的OD600达到0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，16℃诱导表达8h。取诱导前后阳性菌及对照菌样品行SDS-PAGE电泳检测表达情况并按纯化系统说明书对表达的重组酶进行纯化。

1.4 纯化蛋白质含量的测定

以考马斯亮蓝染色法测定纯化的蛋白质的浓度。取8只试管，以结晶牛血清白蛋白为标准蛋白质，用0.15mol / L NaCl配制成1.3 mg / mL蛋白溶液，按表1进行平行操作，混匀，静止10min。1h内以0号管为空白对照调零，测得595nm处各管吸光度值，重复测定3次，取平均值。以吸光度为横坐标，标准蛋白浓度为纵坐标，绘制蛋白浓度-吸光度曲线。根据样品管（7号管）的吸光度值，得到三种纯化重组酶的蛋白质浓度（mg/mL）。

表1绘制标准曲线—试剂组成

Table 1 The protraction of the standard curve — the constitution of reagents

试剂 管号 0 1 2 3 4 5 6 7

0.15mol/L NaCl(ul) 25 21.1517.313.59.626 0 0 标准蛋白溶液(ul) - 3.857.7 11.5 15.3819 25 -

样品(ul) - - - - - - - 25

蛋白浓度 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.3

考马斯亮蓝试剂1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

（ml）

1.5 酶活力检测

以活性为300U/mg酵母醇脱氢酶为标准蛋白质，配制30U/ml酵母乙醇脱氢酶反应液。在25℃下，吸取pH7.5的100 mmol/L磷酸钠溶液0.5ml、33mmol/L乙醇溶液0.1ml、2.4mmol/L

，加入标准酶制剂0.1ml，立NAD+溶液0.1ml、蒸馏水2.2ml置于石英比色杯中（容量4ml）

即混匀，测定A340nm，以后每隔15s测一次，直至A340nm不变，记下反应时间和A340nm读数。于

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