活体动物体内生物发光和荧光成像技术(12)

活体动物体内生物发光和荧光成像技术基础原理与应用简介

优 生物发光

点

缺

点

特异性强，无自发荧光 信号较弱， 检测时间较长， 需要灵敏的 CCD 镜头， 高灵敏度，在体内可检测到几百个细胞 仪器精密度要求高； 检测的深度在 3-4 厘米 精确定量 需要注入荧光素，实验成本高； 细胞或基因需要转基因标记； 有些物质不能用生物

发光标记，如抗体、多肽等 很难用于人体。

荧光

荧光染料、蛋白标记能力强，多种蛋白 非特异性荧光限制了灵敏度，体内检测最低约 105 及染料可用于多重标记； 信号强度大，成像速度快； 细胞； 检测深度受限制；

实验成本低； 较难精确体内定量。 活体动物、动物尸体、器官全部可以进 行成像； 可衔接体内实验和体外实验，保持研究 的连贯性； 未来可能用于人体。 四、活体动物可见光成像仪器原理与操作流程 (一) 仪器原理 以 NightOWL ⅡLB 983 为例，来说明活体动物可见光成像系统的仪器设计原理。整个仪器由 CCD 配合密闭性 非常好的暗箱、荧光配件、麻醉系统和软件组成。CCD 镜头位于暗箱的左上方，荧光光源和光路位于右上方， 动物平台(可加热，以保持观察实验动物的体温)位于暗箱的下方，麻醉系统通过管道与暗箱连接。 选择适当的 CCD 镜头，对于体内可见光成像是非常重要的。选用的 CCD 镜头对于波长 450-700nm 的光必须具 有非常高的灵敏度和量子效率，而且由于需要探测的光源在皮下几厘米处，其噪声信号要尽可能的小。科研人 员经过探索发现，背照射背部薄化冷 CCD 是唯一合适的选择。这种 CCD 芯片温度可达<-800C,在该温度下， 芯片的暗电流和阅读噪音降到几乎可以忽略不计的水平，同时配合密闭性非常好的暗箱，使得该系统检测生物 发光和荧光具有无与伦比的灵敏度。CCD 由软件控制升降，自动聚焦，可以获得从 3.5 厘米到 25 厘米的连续 视野。 成像暗箱屏蔽宇宙射线及一切光源，可以使暗箱内部保持完全黑暗，CCD 所检测的光线完全由被检动物体内发 出，避免外界环境的光污染。 在荧光配件的设计方面，光源采用 75W 的钨卤灯，该系统首先实现了荧光激发光源能量从 0%-100%可调节， 并通过光导纤维反馈控制激发能量在检测时间内保持稳定，有利于定量的准确性。另外，还通过采用均匀照射 的激发装置、窄波带的滤光片等保证荧光成像能较好的去除背景噪音的影响，获得清晰的检测结果，较准确的 定量数据。 为了对实验动物进行可见光成像，需要将实验动物进行麻醉，以获得期望的观察角度及稳定的数据。对于生物 发光成像来说，由于检测的时间较长，一般建议使用气体麻醉。气体麻醉系统组成包括：气体蒸发器、诱导麻 醉箱、流量调节阀、单独控制开关的五通道小鼠麻醉室、废气吸收装置等组成。在成像前，将实验动物置入诱 导麻醉箱并被麻醉, 然后放入成像暗箱进行观察 软件系统负责仪器控制和图像分析。软件控制镜头的焦距、CCD 的升降、曝光时间、滤光片的更换和照明灯的 开启等，具有友好的

用户界面，操作简便。 (二) 实验操作流程

活体动物体内生物发光和荧光成像技术基础原理与应用简介

1. 细胞标记或动物标记等

进行生物发光实验，首先根据实验内容的不同，用荧光素酶基因标记肿瘤细胞、干细胞、病毒、药物载体或动物，或者用Lux操纵子标记细菌。用荧光素酶基因标记可通过质粒、慢病毒或逆转录病毒等方法进行。

如果进行荧光实验，就用GFP、EGFP或RFP标记肿瘤细胞、干细胞、病毒或动物等，后者用荧光染料（包括量子点）标记需要检测的物质，如抗体，药物载体等。

2. 体外预实验检测

需要检测的细胞、病毒、细菌等标记后，在活体成像前，可以通过多孔板预先检测一下标记是否成功，荧光素酶或荧光蛋白的表达强度等，并据此筛选阳性克隆、绘制标记物的发光梯度曲线等。体外预实验是作为小动物活体成像解决方案中不可缺少的一部分。比如，利用体外预实验初步检测转染荧光素酶的肿瘤细胞发光值，选择转染率相对高且稳定的一批细胞进行体内实验。对于通常进行的细胞检测来说，具体可以通过活体成像仪器检测活细胞的发光强度，也可以通过体外化学发光和荧光检测仪检测细胞裂解液的发光强度。

当用体外化学发光和荧光检测仪时，可以更准确地捕捉到发光值、更稳定的输出发光值。对于生物发光方式而言，实验所需的仪器是微孔板式化学发光检测仪，如Berthold Centro LB 960。对于荧光方式而言，实验所需的仪器是微孔板式荧光检测仪，如Berthold TwinkleTM LB 970。(图11-7)

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