活体动物体内生物发光和荧光成像技术(2)

活体动物体内生物发光和荧光成像技术基础原理与应用简介

荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素。荧光素在氧气、ATP存在的条件下和荧光素酶发生反应，生成氧化荧光素(oxyluciferin)，并产生发光现象。

对于细菌标记，一般利用发光酶基因操纵子luxABCDE或luxCDABE，其由控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成。利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物。但是一般细菌标记需要转座子的帮助把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达。

2. 底物荧光素的特点

荧光素由于诸多优点得到广大科研人员的青睐，主要特点如下：

(1) 荧光素不会影响动物的正常生理功能。

(2)荧光素是280道尔顿的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透细胞膜和血脑屏障。

(3) 荧光素在体内扩散速度快，可通过腹腔注射或尾部静脉注射进入动物体内。腹腔注射扩散较慢，持续发光长。荧光素腹腔注射老鼠后约1min后表达荧光素酶的细胞开始发光，10min后强度达到稳定的最高点，在最高点持续约20~30 min后开始衰减，约3h后荧光素排除，发光全部消失，最佳检测时间是在注射后15~35min之间；若进行荧光素静脉注射，扩散快，但发光持续时间很短。科研人员根据大量的实验总结出荧光素的合适的用量是150mg/kg，即体重20克的小鼠需要3毫克的荧光素。

(4) 观察时间的间隔没有最短限制，只要观察的条件控制一致就可以。虽然底物在动物体内有一定的代谢过程，但是上一次底物的残留曲线可以知道，可以控制对下一次观察结果的影响。

3. 光学原理

光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。血红蛋白（hemoglobin）是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于600纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小。因此，在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。利用活体动物生物发光成像技术最少可以检测到皮下的几百个细胞。当然，由于发光源在老鼠体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的。一般认为，每一厘米深度，发光强度衰减10倍，血液丰富的组织或器官（比如心脏、肝脏、肺脏）衰减多，与骨骼相邻的组织或器官衰减少。在相同的深度情况下，检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系，可由仪器量化检测到的光强度，反映出细胞的数量。

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