BD FACSCalibur中文培训手册(2)

BD F ACSCalibur 中文培训手册璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为430×180um的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。

流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流环包。鞘液流是一种稳定流动，操作人员无法随意改变其流动的速度,样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。

图二

细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即P = (?) pv2 (忽略高度的变化)，可见只要压力恒定，就可得到恒定的鞘液流流速, 从

而可确保每个细胞流经激光照射区的速度不变。

低速(Low) 高速(Hi)

图三

从图二可以知道,真空泵产生压缩空气,通过鞘流压力调节器加在鞘液上一恒定的压力(压

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图四

力的大小由工厂设定)，这样鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的。而改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度，但是，这并不是提高样本流的速度，而是改变了细胞间的距离，从图三可以看出，样本流变宽，细胞间距离缩短,这样单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加。这种情况应在具体实验中引起注意，由于激光焦点处能量分布为正态分布(见图四)，中心处能量最高，因此当样本速率选择高速(Hi)时，处在样本流不位置的细胞或颗粒，受激光照射的能量不一样，从而被激发出的荧光强度也不相同，这就会造成测量误差，当在检测分辨率要求高的实验时(如 DNA analysis)应选用低速(Low)。

（二）、激光光源与光束成形系统

目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器，BD公司的FACSCallibur可增配小功率半导体激光器（波长635nm)从而拓宽了其染料的应用范围。

激光 (Laser, light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，这是因为由于细胞的快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为１微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。

激光光束在到达流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为22 × 66 um即短轴稍大于细胞的直径的光斑(见图四)。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞是一个一个分别受到光照并且受照强度十分一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处，台式机FCM的光路调节对用户是封闭的，即安装时由工程师调试完毕后，无需用户作任何调节，所以用户操作十分方便。

（三）、光学系统

FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。

在FCM的光学系统中主要光学原件是滤光片( Filter )，主要分为三类：长通滤片（Long--Pass Filter，LP )、短通滤片( Short--Pass Filter,SP) 及带通滤片( Band--Pass Filter, BP )。

(1) 长通滤片：长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如LP500滤片，将允许500 nm以上的光通过，而500 nm以下的光吸收或返回。

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图五

(2) 短通滤片：与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。

图六

(3) 带通滤片：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光波段的范围。如BP 500 / 50表示其允许通过波长范围为

475nm～525nm。

图七

（四）、信号检测与分析

当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号，图八是

以激发光光源波长488nm为例的示意图：

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图八

散射光信号：散射光分为前向角散射( FSC ，Forward Scatter ) 和侧向角散射(SSC，Side Scatter)，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，因此被称为细胞的物理参数（或称固有参数）。

(1) 前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小有关，确切说与细胞直径的平方密切相关，通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。

(2) 侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交900方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。

上述两种信号都是来自于激光源光束，其波长与激光相同，目前采用这两个参数组合，可区分红细胞裂解处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和粒细胞三个细胞群体，或在未进行红细胞裂解处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。

荧光信号：当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析就能了解所研究细胞参数的存在与定量。

荧光染料可选用的荧光素有多种多样，由于它们分子结构不同，其荧光激发谱与发射谱也各异。选择染料或单抗所标记的荧光素必须考虑仪器所配置光源的波长，目前台式机FCM常配置的激光器为488nm，通常可用染料有PI(propidium iodide)、PE(phycoreythrin)、FITC(fluorescein isothiocyanate)、PerCP(peridinin chlorophyll protein)、CY5等。

另外，BD公司推出的FACSCalibur还可配置半导体激光器（波长为635nm），可激发APC、To-Pro3等染料，更拓宽了流式细胞仪的应用范围。

(1) 荧光信号线性测量和对数测量：

荧光信号的线性测量与对数测量主要由电子线路完成。从图一可知，当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT 将光信号转换成电信号。有些厂家不采用光电倍增管(PMT)，而采用线性放大光电转换器，其优点是降低成本提高线性度，但其最大缺点是响应速度慢，造成仪器分析细胞速度降低，最高不可能超过3300个/秒，如果样本流速超过此速度会导致数据损失，因此高档机器不采用此种方法。电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。线性放大器，即放大器的输出与输入是线性关系，细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。但在细胞膜表面抗原等的荧光检测时通常使用对数放大器，如果原来输出是1，当输入增大到原来十倍时，输出为2；当输入增大到原来一百倍时输出为3等。在免疫学样品中，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍甚至几万倍。如用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。

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(2) 荧光信号的面积和宽度

所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA倍体测量时采用面积（如FL2-A），这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA的含量，当形状差异较大，而DNA含量相等的二个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的，经过对荧光信号积分后，所得到的信号值就相等。

宽度（如FL2-W）常用来区分双联体细胞(B-D公司的专利技术)，由于DNA样本极容易聚集，当两个G1期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA荧光信号（FL2-A）与G2期细胞相等，这样得到的测量数据G2期细胞比例会增高，影响测量准确性，图九是用小牛胸腺细胞测量得到的DNA分布曲线，图九－b中G2形成了小峰，其中，有一部分是因为G1期细胞粘连在一起，形成假G2期细胞，而图九－a是通过设“门”（gate），将双联体细胞排除，其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W）要比单个G2期细胞大，因此设“门”后才能得到真正的DNA含量分布曲线和细胞周期（图九－c）。

a b c

图九

(3) 光谱重叠的校正

当细胞携带两种荧光素如（PE和FITC）受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时，理论上，可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。但由于目前所使用的各种荧染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠，从图十中可以看出，阴影为探测器检测光谱的范围，FITC探测器会探测到少量的PE光谱，而PE探测器则检测到较多的FITC光谱。克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路，利用标准已知样品或荧光小珠，可合理设置荧光信号的补偿值。图十一给出补偿前后模型图。

图十

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图十一

BD公司生产的FACSCalibur 四色FCM系统，采用双激光立体光路技术，就是为了减少各荧光间相互补偿，其原理通过图十二可以知道：点A通过透镜f成像在A’处，而点B通过透镜f成像在B’处。在光电倍增管前放上一小孔，作为空间滤波器，排除其它杂散光信号，从而确保了A点光源进不了B’点处，B点光源也进不了A’点处，因此就可避免有第一激光(488nm)激发出的FL1、FL2、 FL3 和第二激光(635nm) 激发出的FL4间的补偿。当然FL1、 FL2、和FL3是来自于同一点光源，它们之间的补偿是不可避免的。

（五）、 FCM测量数据的存贮、显示与分析

目前FCM数据的存贮的方式均采用列表排队(List Mode)方式。因为目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物已可多达4个，采用List Mode方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被检测4个测量参数，那么获取一万个细胞，所占容量为4×10000个(字或双字)。同时当只检测细胞一个参数时（如DNA)，可灵活的关闭其他三个参数，节省四分之三的空间。数据文件虽然有易于加工处理分析的优点，但缺乏直观性，数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。

1、单参数直方图：

细胞每一个单参数的测量数据可整理成统计分布，以直方图(distribution histogram)来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数，横坐标可以是线性的，也

可以是对数的，纵坐标一般是细胞数。

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图十三

左上图较低道数处为G1期细胞，道数为G1期细胞两倍得是G2+M期细胞，二者之间是Ｓ期细胞。右上图100 ~ 101为阴性细胞，而101以上为阳性细胞。

2、双参数数据的显示

参数数据的显示是用于表达来自同一细胞两个参数与细胞数量间的关系, 常用的表示方法有二维点图(Dot Plot), 等高线图(Contour Plot), 二维密度图(Density Plot)。在二维图中, X坐标为该细胞一参数的相对含量, 而Y坐标为该细胞另一参数的含量, 从双参数图形中可以将各细胞亚群区分开, 同时可获得细胞相关的重要信息, 左下图为FSC和SSC组成的点图, 从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞, 单核细胞及粒细胞区分开,从而可以分别分析各细胞亚群的统计数据, 右下图是通过设“门”分析(Gating analysis)得到的FL1和 FL2点图,设“门”可以是单参数设“门”,也可以是双参数设“门”,通过设“门”可调出其他参数的相关信息,被调出的信息同样也可以是单参数和双参数。图十四就是通过细胞的前向和侧向散射光双参数点图,设“门”圈出标本中的淋巴细胞群体,再调出免疫荧光的点图。

图十四

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等高线图密度图

图十五

1.3 流式细胞仪的主要技术指标

1、荧光测量灵敏度

灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标，一般以能检测到单个微球上最少标有FITC或PE荧光分子数目来表示，一般现在FCM均可达到<600个荧光分子。

2、仪器的分辨率

分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV (Coefficient of Variation)值来表示： CV＝δ/μ×100% (δ是分布的标准误差，μ是分布的平均值)

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