Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法）
人工肝实验室学习 姚瑶
（一） 目的蛋白提取：
（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。
2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。
共洗三次，每次十分钟。
3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP管内，-20℃裂解30min。
4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。
6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取：
1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。
3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用 （二）蛋白含量的测定：
1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。
3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。
4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。
5、37℃水浴30min。
6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。
（三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样：
1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
分子量范围凝胶浓度（%） （KB） 5 10 25-200 10-70 15 20
<50 <40 以5ml 10%分离胶、3ml 5%浓缩胶为例：
10%
5%浓缩胶
去离子水 1.9ml 2.1ml
30%聚丙烯酰胺 1.7ml 0.5ml
1.5M Tris-HCl（Ph8.8） 1.3ml ------
1.0M Tris-HCl（Ph6.8） ------- 380ul
10%SDS 50ul 30ul
10%AP 50ul 30ul
TEMED 2ul 3ul
2、处理蛋白：计算含20-50ug蛋白的溶液体积即为上样量，
分
离
胶
加入上样量等体积的2×上样缓冲液Buffer，再加入上述总体积1/10的β-巯基乙醇，混匀后，放入PCR仪内，95℃反应10min。 3、加样：加入1×Tris-甘氨酸电泳液，电泳液至少要漫过内侧小玻璃板，取下梳子，安装好电泳槽，倒入缓冲液，微量加样器加样。需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染。 （3）电泳：100V，20min，待溴酚蓝成一直线后，150V，电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳(一般1.5h)，取出跑好的凝胶，切胶至适合大小。进行转膜。也可在转膜前验证是否有目的条带，使用考马斯亮蓝液置于摇床 染色12h。染完后观察，用脱色液脱色，20min/次，直至透明。再进行转膜。
（四）转膜：
配制1×转膜缓冲液（现配）。一般配制成10×转膜缓冲液储存。需要时配制成1×现用。PVDF膜需用甲醇激活(15s)，注意戴手套、赶走气泡、胶与膜的位置、膜的正反面。
放置顺序为：海绵--滤纸2层—PVDF膜—凝胶--滤纸2层—海绵。（大小：凝胶>滤纸>PVDF膜） （五）免疫反应：
1、5%脱脂奶粉封闭，4℃过夜。 2、一抗孵育。
3、洗膜：PBST/TBST洗膜3次，10min/次。 4、二抗孵育。
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