11 凝胶过滤法分离纯化大豆蛋白肽(3)

第 1期 凝胶过滤法分离纯化大豆蛋白肽 29

正交实验结果见表2，从表中可以看出：在温度和pH值固定的条件下，影响大豆分离蛋白水解反应速度的主次因素依次是：酶用量、底物浓度、酶解时间。三个因素极差都大于空白列极差，表明实验主次因素的结论是可靠的：空白列极差很小，说明各因素之间交互作用不明显，可以忽略不计；中性蛋白酶AS1.398水解大豆分离蛋白的最优方案是B3A3C3，即酶解条件为：酶用量为6%、底物浓度为5%、酶解时间为4h，在此条件下水解，水解度可达到24.57%。

在正交实验的9种方案中，第9种（A3B3C2）水解度最高，达到20.28%。因为酶解时间对酶解反应速率的影响不是很明显，因此为了提高水解度和节省时间可以适当的降低酶解反应时间，当采用方案A3B3C1，即底物浓度为5%（W/V）、酶用量为6%，酶解时间为2h，即为正交实验中的第8种方案，水解度为18.84%。它与最优方案B3A3C3的水解度24.57%相差较多，因此考虑到经济效益不能采用A3B3C2。综上所述，通过正从而最终确定了AS1.398中性蛋白酶水解大豆分离蛋白的最佳工艺条件是：交实验得出的优化组合A3B3C3，

T=48℃、pH值为7.5、底物浓度为5%（W/V）、酶用量为6%、酶解时间为4h，此条件水解度可达24.57%。 2.2 凝胶过滤分离

如图1所示，由分子量标准谱图的出峰位置可知第20管以后是分子量为1200以下的，以此可以进行判断大豆肽的分子量肽段。

从图2可以看出，根据分子量的大小，大豆肽被分成了几个组分，分离效果较好。20管以后是实验要收集的肽段，即分子量1200以下的大豆肽。

根据蛋白含量数据可知，SepHadex G15分离得到的小肽居多，说明本实验选用AS1.398中性蛋白酶水解分子量为1200以下的小肽具有很好的选择性且G15的分离效果较好。

3 结论

用中性蛋白酶AS1.398水解大豆分离蛋白的最佳反应条件为：水解温度、pH值分别为48℃和7.5，底物浓度为5%（W/V），酶用量为6%，酶解时间为4h，此时水解度（DH）达到24.57%。

采用活性炭脱苦对大豆蛋白酶解液中疏水性苦味肽进行选择性吸附分离脱苦、脱色所得的大豆肽口感风味都较好。

柱层析效果较好，得到了我们想要得到的大豆肽产品。用AS1.398中性蛋白酶水解分子量为1200以下的小肽具有很好的选择性且G15的分离效果较好。通过柱层析分离出的分子量为1200以下的大豆肽可以进一步采用高效液相制备色谱分离以获得更高纯度的大豆肽产品。

参 考 文 献

[1] Aggregation of Peptides during Hydrolysis as a Cause of Reduced Enzymatic Extractability of soybean Meal proteins.J.Agric.Food chem.2002.50：4512～4519

[2] 张新会，杨晓泉，陈中，姚玉静.大豆肽的分级膜分离及功能特性研究[J].中国粮油学报，2003.18（6）：49～52 [3] 刘大川，钟方旭.酶水解法制备大豆肽的研究[J].中国油脂，1997;(6):14～16 [4] 黄骊红.大豆多肽生理功能及应用（一）[J].食品科学技术，1999;(3):50～51

[5] 郑环宇，邵弘，刘燕，朱秀清，武丹.酶水解大豆分离蛋白制取大豆肽的应用研究[J].大豆通报，2003（4）：25～26

30 齐 齐 哈 尔 大 学 学 报 2006年Separation and purity of the soybean peptide by gel filtration chromatography

ZOU Cun-yuan ZHENG Yong-jie LU He

(School of chemistry and chemical engineering, Qiqihar University, Qiqihar 161006)

Abstract：In the article we hydrolyzed the soybean protein with Neutrase As1.398, and determined the optimum conditions for hydrolysis by orthogonal test, the experimental results showed DH of soybean peptide could be up to 24.57% at the optimum conditions which were pH: 7.5, temperature: 48℃, enzyme dosage: 6%, reaction time: 4h. We separated and collected the soybean oligo peptide with the methods of ultrafiltration and gel filtration chromatography after decoloured and debittered the hydrolysate.

Key words：soybean peptide；enzymatic hydrolysis；ultrafiltration；gel filtration chromatography PDS—脱硫催化剂的测定方法研究

PDS生产厂家提供了对其主组分的测定方法，但它是在背景干扰很小状态下测定的，而我厂脱硫液中含有色物质栲胶且成分复杂，测定结果有时出现负值，数据也不够准确。本文对PDS测定方法加以改进，采用处理过的不含PDS的脱硫贫液代替蒸馏水做底液，重做标准工作曲线，取得了较好的结果。 1

实验部分

1) 配制脱硫液：根据实际生产经验，在3000mL水中加入适量V2O5、Na2CO3、栲胶，加热溶解。2) 模拟脱硫过程：35℃恒温水浴，接欲脱硫煤气通入配制好的脱硫液中，进行脱硫反应，通气24h。3）模拟再生过程：35℃恒温水浴下通空气30min，使还原态栲胶氧化成氧化态。4）测定其中的Na2CO3、NaHCO3、NaVO3、Na2SO4、Na2S2O3、栲胶、pH的含量，与实际脱硫液中各组分含量进行比较，调节直至各组分值均相符。5) 过滤脱硫液,去掉其中的悬浮硫和其它杂质。 1.2 做标准工作曲线

1） 精确称取0.2500 g PDS（采用生产上使用的样品，于120℃烘干4h）,置于250mL烧杯中,加入适量不含PDS的脱硫液,充分搅拌使之溶解,并移入1000mL容量瓶,用脱硫液稀释至刻度,摇匀后即为PDS标样贮备液。2) 用吸量管分别吸取1 、2 、3 、4、5、6 mLPDS标液于50 mL容量瓶中，用脱硫液稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为5、10、15、20 、25 、30 mg/L的脱硫剂标准溶液。 3) 以脱硫液为空白,将系列PDS标准溶液置于1cm比色皿中,因脱硫液中干扰物质较多，所以利用721分光光度计,分别在670nm和740nm的波长下测出它们的吸光度。4）求得吸光度差APDS=A670-A740为Y值，对应的标准浓度为X值，绘制吸光度标准曲线。 1.3 未知样测定

取未知脱硫液，加热并通空气，然后过滤，除掉杂质，以不含PDS脱硫液为空白，在波长670nm和740nm处测定滤液吸光度，将算得的吸光度差代入线性回归方程，计算出未知样中PDS的浓度。 2 实验数据与线性回归方程

PDS浓度与吸光度差呈线性关系,线性回归方程为Y=0.032+0.0071X 3 结果与讨论

1）以不含PDS的脱硫液代替蒸馏水为空白，并做配制PDS标准溶液的底液,可以使做标准曲线时的各种分析条件与实际测量样品时的条件完全一致,减少测量误差。

2）因实际所用脱硫液中含有少量栲胶,栲胶具有一定的颜色,这种颜色会产生背景干扰,采用双波长测定法,可以有效的除掉干扰,结果比较准确。

（樊 玲，黑龙江黑化集团有限公司，齐齐哈尔 161041）

1.1 配制不含PDS的脱硫液

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