实验八 感受态细胞的制备与转化

基因工程 转化

实验八

大肠杆菌感受态细胞的 制备与转化

基因工程 转化

实验目的

1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意

义。

2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选 转化体的方法。

基因工程 转化

实验原理

转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引

入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性

状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、

基因工程等研究的基本实验技术。

基因工程 转化

转化中的受体细胞

转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰

系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲

基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。

基因工程 转化

实验原理

转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学 试剂法 感受态细胞：的处理后，细胞膜的通透性发 生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时 细胞的状态。 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的 受体细胞( Transformant )。

基因工程 转化

实验原理

本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携 带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质 粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符 号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适 应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养， 只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞 则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。

基因工程 转化

抗Amp

宿主细菌

含Amp培养基

基因工程 转化

影响转化率的因素

细胞生长状态和密度。

转化的质粒 DNA 的质量和浓度。

试剂的质量。

防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。

基因工程 转化

实验仪器

基因工程 转化

超净工作台

基因工程 转化

台式高速冷冻离心机

基因工程 转化

恒温空气摇床

基因工程 转化

恒 温 培 养 箱

培 养 皿

基因工程 转化

实验试剂

大肠杆菌DH5α LB培养基， 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷） 氨苄青霉素 pUC18质粒

基因工程 转化

实验步骤

菌株活化 感受态细胞制备 外源DNA的转化

基因工程 转化

实验步骤

菌株活化

1.

用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培 养基平板表面划线，于37℃培养16小时

2.

挑取一个单菌落，转到3－5ml LB培养基中，于 37℃培养3－5小时

将培养液全部转到100ml LB培养基中培养2－3 小时，到OD600＝0.3－0.4

3.

基因工程 转化

实验步骤

感受态细胞制备

4.

将 培 养 液 转 入 1.5ml 离 心 管 中 ， 在 冰 上 放 置 15 － 30min

5. 6.

4000rpm离心5min,弃上清

加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预 冷10min 4000rpm离心5 min,弃上清 加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使

7. 8.

用。也可加入总体积15％的甘油

存

可－70℃长期保

基因工程 转化

实验步骤

转化 取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于 冰上放置30min 于42℃水浴90S 冰上放置2min

基因工程 转化

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基因工程 转化

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