质粒与载体(5)

质粒与载体

插入外来基因并做为选殖株(clone)和非选殖株(non-clone)的辨识。此外它们的基因体要小，以便于操作和细胞转形。

利用质粒发展成载体第一个最成功的例子是pBR322(Bolivar et al, 1977)。它含有pMB1的复制原、pSC101的抗四环霉素(tetracycline)基因tet和Tn3(一种转位子)的抗青霉素(penicillin)基因bla。你可以把外来基因插在这两个抗药基因中的任何一个内，利用中断抗药基因的消失做选殖筛选，利用剩下的一个完整抗药基因做转形株筛选。因为pBR322的成功构筑，才使基因选殖有了长足的进展。

细胞转形(cell transformaiton)是基因选殖的重点工作之一。但细胞的转形率与外来DNA 的大小成级数反比。以几万碱基对大小的DNA 来转形大肠杆菌细胞几乎是不可能的。为了改善这种情况，结合了pBR322的载体特性和噬菌体λ(lambda)的壳蛋白包裹(packing)特性发展出cosmid pHC79 (Hohn and Collins 1980)。噬菌体λ的基因体由48,502个碱基对构成。它在宿主中的DNA 复制产物是多个λ基因体相连的多元体(concatemers)。当噬菌体壳蛋白接近完成时才将λ基因多元体由一端「吸入」。当壳蛋白已经包裹了约相当于λ基因体75%的DNA (约36,000碱基对)时，一个特殊的λ DNA 内切?开始被活化并寻找适当的切点以便切开λ基因多元体完成包裹动作。如果壳蛋白已经包裹了约相当于λ基因体110%的DNA (约54,000碱基对)还没发现适当的切点时，包裹动作就会被放弃。这个「适当的切点」平时就在线状λ基因体DNA 的两端，称为 cohesive sites (cos)。将噬菌体λ的cos切出植入pBR322中使新构筑的载体兼有质粒载体与可被视为λ基因体而被包入λ壳蛋白中的特性，可使30,000~50,000碱基对大小的DNA 轻易地被选殖出来。因为它结合了λ cos site和plasmid，故称为cosmid。

载体pUCs(如pUC18、pUC19，Yanisch-Perron et al, 1980)则是利用pBR322做了选殖株筛选的进一步发展。它的特点是利用了呈色基因取代了pBR322中的一个抗药基因。大肠杆菌乳醣分解?(β-galactosidase)可分解许多β-半乳醣化合物(β-galactoside)，其中也包括了X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)。X-gal呈淡黄色，分解后呈蓝色。大肠杆菌的乳醣分解?有两个不寻常的特色：1.该酵素N-端的廿几个氨基酸和酵素活性无关，可以任意修改成连串的限制?切点MCS (multiple cloning site)而不影响酵素活性；2. .该酵素基因如果被适当地分成两段(如前段lacZ’和后段lac
ZΔM15)，这两段基因的产物(α-chain和β-chain)尚能互补而具有酵素活性。载体pUCs利用了pBR322的基本骨架，以突变除去抗青霉素基因中的PstI切点，切除抗四环霉素基因并在该处加入具有MCS的lacZ’。至于后段的lacZΔM15则是利用F-质粒或噬菌体带入乳醣分解?

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