谷子肌动蛋白基因的克隆及序列分析(2)

以谷子(Setaria italica)为材料,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物,用5'RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序,

Z期李园莉等：谷子肌动蛋白基因的克隆及序列分析Z--用、胞吐作用以及多种细胞运动如顶端生长、细胞器运动、胞质环流、花粉管生长等（!"#$#%&’(#)(*!")%%+,，-../；!$)’0#%)(*!1"&’,)，-.23）。高等动植物中，肌动蛋白都是由

。这些基因高度相似，通过多轮复制由一个基因祖先进化而来多基因编码（4’%$#&，-.2-）

（5)(0#)(*6%7*"+88#，-...）。

不同生物肌动蛋白具有高度保守性，（%#9&)1#8#($(7:6#%&#%等建立了由核苷酸替代

简称%(;）而引起的氨基酸替代（)8’(+)1’*;7<;$’$7$’+(;）与保守蛋白（如1&#+$’*#;7<;$’$7$’+(;，

珠蛋白、胰岛素、肌动蛋白等）基因进化年代（以百万年计，的线性关系，8’&&’+(=#)%;，5>）

其中对动物、菌类和植物肌动蛋白的估计为-?%(;@-AA5>（BCA5>），即这些生物肌动蛋白的氨基酸残基变化-?约需-AA百万年，暗示着肌动蛋白基因在进化过程中承受着较大的选择压力，在生物体内执行着重要的生物学功能（6#%&#%!"#$，-.2A）。

谷子是起源于我国或东亚的一种禾本科D/作物，营养价值高，多年来人们对其遗传育种方面作了大量工作（李润植等，。我们选取谷子作为材料，对其肌动蛋白基因的-..3）

结构及其功能进行分析，并结合前人的工作，为利用肌动蛋白研究真核生物特别是禾本科植物的进化提供一些资料。

!材料和方法

!"!材料与试剂

谷子（%!"#&’#’"#$’(#），又称粟（谷），采用中品六号，在温室播种，选取培养一周的幼苗提取总EFG。克隆载体为9HI5:CJK（L），参照M)*N#<等（-..O）的方法自制P载体。受体

。各种限制性内切酶为华美公司和6%+8#0)产品，菌为)*(+$’QMCQFG@,’-.#:)(+E!"

R、P/QFG连接酶购自华美公司，P)SQFG聚合酶为T’+;$)%产品，C’EGDIU’$购自VPR，W’X:)%*P55’(’9%#9;QFG67%’K’1)$’+(;=;$#8为6%+8#0)产品，QRHQFGV)<#&’(0)(*Q#$#1$’+(U’$为T+#"%’(0#%5)(("#’8产品，其它试剂均为进口或国产分析纯。

!"#寡聚核苷酸引物

根据文献（M’0"$+,#%)(*5#)0"#%，-.2O）设计引物，由大连P)U)E)公司合成。正向引物6-（YZ!L[A）为C’（GDP）（DGH）（GP）（GH）（HG）（PG）（GH）GDDGPHHDHHGHHHGPZ’；反向引物6[（L---Z!L--Z/）为C’（PD）（PH）（HD）。PPGHGGHDGPPDDHPHGDZ’

!"$总%&’的提取

采用W)*;,+%$"等（-.22）的方法，只是最后改用3C?乙醇洗涤EFG沉淀两次、吸干，溶于-CVQI6D处理的无菌水中。$

!"(%)*+,%扩增

参照C’EGDI说明书进行。

补水至-C\C$!-(-!反转录[\C98+&引物6[，C$0总EFG，V，3A]-A8’(后冰浴-

8’(。加入以下组分：[\C$V-A^6DE缓冲液，[\C$V[C88+&@V50D&[，-$V-A88+&@V

加入-$*FP6;，[\C$VA\-8+&@VQPP。/[]温育-8’(，V!79#%;1%’9$P5%反转录酶，/[]

温育CA8’(，3A]-C8’(终止反应。加-$VEF);#M@EF);#G于Z3]保温ZA8’(降解EFG。

!-(-#

!-(-$./&’的纯化与加尾按说明书进行。在CA$+,%6DE仪为M=<)’*公司产品，V反应体系中依次加入C$V-A^6DE

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