谷子肌动蛋白基因的克隆及序列分析(3)

以谷子(Setaria italica)为材料,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物,用5'RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序,

F&3植物学通报&@卷!"##$%，&’(!)&(**+,-)./012，3’45*+,引物1&，3’45*+,引物13，4!)67/8，390:;7/8聚合酶，用..<3=补充至4(!)。1>?参数：@ABA*CD；@AB&*CD，A4B&*CD，E3B&

用&’3G琼脂糖凝胶电泳检测。*CD，F4个循环后E3B延伸&(*CD，

!"#$%&产物的克隆与序列分析

!’#’!（1H86&，I$DJ:DK/+’$%&产物杂交鉴定将本室豌豆卷须肌动蛋白基因克隆

用!"#"酶切后回收肌动蛋白67/8片段，用地高辛进行标记后作为探针，与所扩LMEMMM）

目的片段的连接、转化、筛选及鉴定参照N:*!%++K等（&@Q@）的方法进行。增片段进行N+"OP$%D杂交。!’#’(

由上海基康公司用8JR1?RNSFEE!’#’)序列测定与进化分析用试剂盒纯化质粒，

序列的拼接、分析采用7/8NRN软件；在/>JR（POO5：7/8测序仪测序，--TTT’D6!C’D,*’DCP’

用J,:2O3’&5%+U%:*（8,O26P",$#%&，&@@E）与I$DJ:DK中已报道的序列进行相似U+V-J)8N0）

性比较。用J)8N0软件在I$DJ:DK中收集已发表的植物肌动蛋白序列，采用7/8N08?软件包（7/8N08?RD6’，&@@M）中的S$U8,CUD进行多序列对齐；再将其输入>,"2O:,W&’Q软件（0P+*52+D$#%&，&@@A）进行多重比较，并用邻位相连法（/$CUP!+%XY+CDCDU，/XZ法）（N:CO+"

绘制进化树，用自展法（J++O2O%:5CDU）对进化树进行评估；最后用0%$$[C$T&’:D./$C，&@QE）

输出图形化的进化树。4软件观看、

(实验结果

("!总&*+的提取

电泳检测结果如图&所示：紫外测定其=73M(-=73Q(\&’@&(，3QN、&QN%?/8条带完整，

表明提取总?/8完整性及纯度均良好。

("(肌动蛋白编码区/0*+的&12$%&扩增结果

4’?8>H方法特点是反转录时使用反向特异性引物，1>?时

使用特异性引物，两步之间加入了67/8纯化步骤以利扩增的进

行。由于本实验所用引物简并性强，加大了扩增的难度，经多次

试验扩增出一长约&’&K!的带，结果如图3所示。

电泳结果（泳道3）表明：通过4’?8>H方法扩增谷子肌动蛋

白基因有明显的主带，大小约为&’&K!，估计可能是肌动蛋白基

因，有待进一步鉴定。

(")3456789:杂交鉴定&12$%&扩增产物图!总?/8甲醛变性电将本室的豌豆卷须肌动蛋白R类异型体基因作为探针与?0X泳

结果如图F所示：结果显示二者同源性很高，进一,-.’!H,$6O%+5P+%$2C2+#1>?产物杂交，O+O:,?/8OP%+"UP:U:%+2$U$,步说明所扩增的片段极可能是肌动蛋白基因。6+DO:CDCDU#+%*:,.$P].$’&，

&(!UO+O:,?/8；3，4!UO+X(";&12$%&产物的克隆与阳性克隆的筛选

将?0X1>?产物不经纯化直接与0载体进行连接，采用蓝、O:,?/8

白斑方法筛选出阳性克隆。结果如图3所示，泳道A白斑质粒明显比蓝斑质粒及空载体的迁移率小，说明它可能插入了目的片段。

("#$%&及酶切鉴定

以筛选出的阳性克隆质粒为模板，用前述引物进行1>?扩增，结果（图A泳道3）表明

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