表观遗传学药物影响乳腺癌细胞系抑癌基因BRCA1及CHD5表达的研究(3)

3次重复检测，取其平均Ct值用于分析。20μL扩

MasterMix10μL，上下游增体系中包括ProbeRT-RTMix0．2μL，引物及探针（20μmol）各0．4μL，

50℃模板RNA2μL。扩增条件为：60℃5min，30min，93℃15min进行逆转录及变性，93℃15s，50℃30s，72℃1min，进行5个预循环，然后以

93℃15s，55℃15s，72℃15s，扩增40个循环，55℃时收集荧光信号。

抑癌基因mRNA表达量变化以公式2△△计算。其中△Ct为每份标本中抑癌基因与GAPDH的Ct值之差，而△△Ct为药物作用组与空白对照组△Ct之差。1．2．3

specificPCR，甲基化特异PCR（Methylation-MSP）方法检测药物作用前后乳腺癌细胞株中

BRCA1及CHD5的甲基化状态基因组DNA采10］的方法进用酚－氯仿法抽提。MSP参照文献［

加入3mol/L行。取1～5μgDNA溶于30μLTE，

NaOH3．3μL，37℃放置10min变性。亚硫酸溶液

须新鲜配制：称取1．82g亚硫酸氢钠，加入2．8mL水和3mol/LNaOH430μL，完全溶解后加入10mmol/L氢醌210μL。混合后，向已变性的DNA

55℃避光水浴4h。中加入该亚硫酸溶液333μL，

以QiaexIIGelExtraction试剂盒回收并纯化后，将

修饰的DNA溶于50μLTE，加入5．56μL3mol/LNaOH，37℃放置15min脱硫，乙酸调pH=7．0，再所得次以QiaexII试剂盒纯化后溶解于50μLTE，

－（

Ct）

DNA溶液即可用于MSP分析。PCR反应循环条

94℃30s，60℃30s，72℃30s，进件：95℃10min，

行40个循环，最后72℃延伸5min。BRCA1甲基

化引物扩增产物长度为75bp，非甲基化引物扩增产物为86bp。CHD5两对引物扩增产物均为119bp。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳、Biored染色后，紫外灯下观察结果。

1．3统计学处理应用SPSS13．0软件，双侧t检

P＜0．05为差异有统计学验法进行统计学分析，意义。

2

2．1

结果

AZA和TSA对乳腺癌细胞系BRCA1表达的

1．0、2．5、5．0和10．0μmol/L5个不同影响经0．5、

7后，浓度的AZA处理乳腺癌细胞T47D和MCF-BRCA1mRNA表达量较空白对照组均有显著提高

（图1）。T47D细胞BRCA1表达量在2．5μmol/LAZA作用48h时达最高值，为空白对照组的9．85

7细胞BRCA1表达量在倍（P＜0．05）；而MCF-

5μmol/LAZA作用48h时达最高值，为空白对照

100细胞经AZA组的20．25倍（P＜0．05）。HBL-BRCA1表达量有所降低，作用后，且5μmol/LAZA

作用72h及10μmol/LAZA作用48h后，均检测不到BRCA1的表达

。

图1AZA对乳腺癌细胞系BRCA1表达的影响

Fig．1InfluenceofAZAontheBRCA1expressioninbreastcancercells

0．5、0．75、1．0和1．5μmol/L5个不经0．25、

7同浓度的TSA处理后，乳腺癌细胞T47D和MCF-中BRCA1的表达在较低浓度药物组24h内呈升高

趋势，并具时间剂量依赖性，且分别在0．5μmol/L和1．0μmol/L时达最高值，为空白对照组的4．39（T47D，P＜0．05）及4．62（MCF-7，P＜0．05）倍；24h后BRCA1表达趋于降低，MCF-7细胞72h时各浓度组均达空白对照组的两倍，而T47D组在0．5μmol/L及更高浓度组48h后均检测不到BRCA1的表达（图2）。低浓度TSA作用对HBL-

100细胞BRCA1表达无影响，0．75μmol/L组48h

72h则检测不到表达。1μmol/L和起表达降低，

1．5μmol/LTSA作用使BRCA1表达降低，两组细

胞均在48h完全脱落，并在12h后即检测不到该基因表达。

2．2AZA和TSA对乳腺癌细胞系CHD5表达的影响7细胞CHD5不同浓度AZA均可使T47D及MCF-表达升高，并分别在2．5μmol/L和5．0μmol/L组48hP＜0．05）达最高值，为空白对照组的4．15（T47D，

7，P＜0．05）倍；72h各浓度组CHD5及6．75（MCF-

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