表观遗传学药物影响乳腺癌细胞系抑癌基因BRCA1及CHD5表达的研究(2)

Results2．5μmol/Lof5-AZAand0．5μmol/LofTSAcouldimproveexpressionsofBRCA1andCHD5inbreastcancercells，whiledrugswithtoohighdoses，10μmol/LofAZAand1and1．5μmol/LofTSAcoulddecreasebothgeneexpressionsandwereeventoxictonormalcells．MSPshowednoalterationsinmethylationstatusofBRCA1inei-thercelllineorCHD5inMCF-7aftertreatment，whilebothagentscouldreversemethylationstatusofCHD5inT47D．Conclusion

Epigeneticdrugshaveadose-andtime-dependentinfluenceontumorsuppressorgeneexpression，andthe

presentstudyprovidesfundamentalexperimentaldatafordesignedepigenetictherapyofbreastcancer．Keywords：Breastneoplasms；Epigenetics；Genes，BRCA1；Genes，CHD5

研究表明，乳腺癌的发生发展过程中不仅存在基因突变或缺失，同时还有异常的表观遗传学改变

［1-2］

为罗氏公司产品。

1．1．3引物及探针序列

。表观遗传学机制导致的抑癌基因功能丧失

本研究所用甲基化特异

PCR引物及BRCA1实时定量RT-PCR引物及探针5，8-9］分别参照文献［设计；CHD5和GAPDH实时PCR引物及探针序列如表1所示，定量RT-由宝生物

是导致乳腺癌发生发展的关键因素。BRCA1

（breastcancersusceptibilitygene1）基因是乳腺癌易感基因，能通过多条信号转导途径抑制细胞增殖，诱

［3］

导细胞凋亡，是一个重要的细胞周期负调控子。CHD5（ChromodomainhelicaseDNA-bindingpro-tein）基因是于2007年新发现的抑癌基因，定位在1号染色体1p36区，通过pl9Arf/p53通路调控细胞衰老和凋亡，是抑癌调控系统的总开关增殖、

［4］

公司设计；所有引物及探针均由宝生物公司合成。

表1

引物及探

针名称CHD5-FCHD5-RCHD5-P

引物及探针序列

序列

5'-CATCCCCTACTACGACAACCTC-3'5'-GACCGTGGGGTCCACAATG-35'-CGGCGGCTTCTCCTGCTTGTCGTC-3'

99163产物长度（bp）

。

。在乳腺癌中，两基因均有较高的甲基化发生率

本研究应用DNA甲基转移酶（DNAmethyltrans-ferases，DNMT）抑制剂5-azacytidine，氮杂胞苷（5-5-AZA）和组蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylase，HDAC）抑制剂TSA（trichostatinA，TSA）对乳腺癌

7及T47D进行处理，细胞系MCF-并以永生化的乳100为对照，腺正常上皮细胞系HBL-观察两种药物

对抑癌基因BRCA1及CHD5mRNA转录表达的影响，同时检测药物作用前后两抑癌基因甲基化状态的改变，以期明确表观遗传学调控对乳腺癌抑癌基因表达的作用，并为表观遗传学药物用于乳腺癌治疗提供实验依据。

［5-7］

GAPDH-F5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3'GAPDH-R5'-TAGCCCAGGATGCCCTTGAG-3'GAPDH-P5'-CCTCCGACGCCTGCTTCACCACCT-3'

1．21．2．1

方法

100、T47D和细胞培养及药物处理HBL-MCF-7三种细胞均培养于含10%小牛血清的MEM培养基。取处于对数生长期的单层培养细胞，消化

5

后计数，调整细胞密度为5×10个/mL，按每孔

1mL接种6孔培养板，接种24h后去上清，加入含5-AZA或TSA的培养液，5-AZA终浓度分别为0、0．5、1．0、2．5、5．0和10．0μmol/L，TSA终浓度分别0．25、0．5、0．75、1．0和1．5μmol/L，同时设不为0、

加药物培养的空白对照组。用药后继续放入37℃、5%CO2培养箱培养，AZA组分别在12、24、然后5-48及72h各收集两孔细胞用以分别提取DNA和RNA，12、24、48及72h各收而TSA组则分别在6、集两孔细胞以分别提取DNA和RNA。1．2．2实时定量RT-PCR分析5-AZA及TSA作

用后乳腺癌细胞抑癌基因的表达变化收集0、0．5、1．0、2．5、5．0和10．0μmol/L5-AZA，0、0．25、0．5、0．75、1．0和1．5μmol/LTSA处理的乳腺癌细

以Trizol试剂提取各组细胞总RNA作为模板，胞，

PCR试剂盒分别检测细利用QuantiTectProbeRT-CHD5mRNA的表达，胞中BRCA1、并同时检测管家基因GAPDH作为内参照。每份RNA样品都做

1

1．1

材料与方法

材料细胞系

1．1．1

MCF-7，人乳腺癌细胞系T47D、人

100均购自中国科学院上海乳腺上皮细胞系HBL-生命科学研究院。

MEM培养基主要试剂及仪器小牛血清、AZA、TSA、为Gibco公司产品。5-亚硫酸氢钠（so-

1．1．2

diummetabisulfite）、氢醌（hydroquinone）为Sigma

Quanti-公司产品。Trizol为Invitrogen公司产品，TectProbeRT-PCR试剂盒及QiaexIIGelExtractionVeriti扩增仪为试剂盒均购自Qiagen公司。Multi-AB公司产品，LightCycler480II实时定量扩增仪

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