A4重点-酶法脱除黄芪多糖中的蛋白质(2)

食品技术

相与有机相的分离困难，容易造成样品损失，且有机溶剂具有毒性和腐蚀性，可谓昂贵、费时、费力、危险[2]。蛋白酶法脱除多糖中的蛋白质是一种比较有前途的方法。刘成梅[3]等对百合多糖脱蛋白的方法进行了研究，对比了Sevag法、三氯三氟乙烷法与Sevag法联用、酶法与Sevag法联用4种方法，得出酶法与Sevag联用法优于其它方法。徐建祥[4]等将酶法脱蛋白技术应用于螺旋藻多糖提取工艺，结果表明，采用酶法脱蛋白的效果优于Sevag法脱蛋白。李国文[5]等将木瓜蛋白酶应用到中药加工中，发现木瓜蛋白酶的酶解效果极其显著。

据报道黄芪多糖中蛋白质含量比较高(≥15%，凯氏定氮法)，脱除其中的蛋白质有助于提高其临床效果和扩展应用范围。目前尚未见到酶法脱除其中蛋白质的报道，因此本文研究酶法脱除黄芪多糖的蛋白质。选用了5种工业化蛋白酶，即木瓜蛋白酶、中性蛋白酶1、中性蛋白酶2、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶，探讨每种蛋白酶的作用效果，并与Sevag法脱除蛋白的效果对比，确定适合黄芪多糖脱除蛋白的酶制剂以及处理条件，以期找到一种能够工业化应用的黄芪多糖中蛋白脱除方法。 1 材料与方法 1.1 原料与试剂

黄芪多糖粗品：自制[6]；木瓜蛋白酶(9万U/g)、中性蛋白酶1(7万U/g)：北京奥博星生物技术公司；中性蛋白酶2(5万U/g)、酸性蛋白酶(4千U/g)、碱性蛋白酶(10万U/g)：北京市房山酶制剂总厂。

无水乙醇、氯仿、正丁醇、95%乙醇、85%磷酸：分析纯；考马斯亮蓝G-250和R-250：SIGMA公司；低分子量标准蛋白：Amersham。

旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；TU1800SPC紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；AB204-B型电子分析天平：瑞士梅特勒公司；LGJ-18型冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂；LXJ-ⅡB低速大容量多管离心机：上海安亭科学仪器厂；电泳装置：AE-6400 Dual Mini Slab Kit，日本ATTO公司。

1.2 酶法脱除黄芪粗多糖中的蛋白质

配制一定浓度的黄芪粗多糖溶液，加入适量的蛋白酶，在该酶的最适温度下酶解一定时间，100℃沸水中煮5min灭酶，加入4倍体积的无水乙醇进行醇沉，得到的多糖进行蛋白质测定。为了避免pH调节影响多糖的生理功能，酶解过程不调pH值。

1.3 最佳酶解条件的确定

最佳酶用量的确定：配制3%的粗多糖溶液，分别按0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0U/mg多糖粗品加入5种蛋白酶，在50℃下酶解6h。灭酶、醇沉、离心，测定各沉淀物中的蛋白质含量。

最佳酶解时间的确定：取一定量的多糖粗品溶液，在酶用量试验所确定的各种蛋白酶的最适用量条件下进行酶处理时间的试验，分别酶解0.5、1、2、3、4、5、6、7、8h，灭酶、醇沉、离心，测定各沉淀物中的蛋白质含量。

1.4 Sevag法脱蛋白[7]

配制一定浓度的粗多糖溶液，加入其体积1/3的氯仿-正丁醇(4∶1)溶液，振摇30min，3000r/min离心1min，取少量水相测蛋白量，将水相再加入相当于其体积1/3的氯仿-正丁醇溶液，重复若干次直到蛋白质含量比较稳定。

1.5 多糖中蛋白质含量的测定

蛋白质定量方法很多，如凯氏定氮法、考马斯亮蓝G-250染色法、双缩脲法、紫外吸收法、福林—酚法等。根据有关研究对比[8]，采用考马斯亮蓝G-250染色法，以牛血清蛋白为标准进行测定[9]。

1.6 SDS-聚丙烯酰铵凝胶电泳(PAGE)鉴定多糖中的蛋白质

多糖中蛋白质的鉴定采用SDS-聚丙烯酰铵凝胶电泳(PAGE)的方法进行，加SDS的分离凝胶浓度为12.5%，按照Laemmli[10]方法进行蛋白电泳。分别配制5%的多糖溶液，加样品处理缓冲液煮沸3min，上样量25ìL；电泳条件为恒电流30mA；电泳结束后用考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue R-250)染色。 2 结果与讨论

2.1 蛋白酶用量对多糖中蛋白质脱除的影响

不同蛋白酶用量对多糖中蛋白质脱除效果的影响见图1，可以看出，蛋白酶的用量较低时多糖中的蛋白质含量均随各种蛋白酶用量的增加而减少，但当酶用量达到一定程度后，蛋白质脱除效果不再明显增加。结果说明虽然作用效果因酶的特异性而存在差异，但所选5种蛋白酶都能降解多糖中的蛋白质，从而起到脱除其中蛋白质的效果。为节省酶用量及防止过多酶蛋白进入酶解液，因此，木瓜蛋白酶的用量以2.5U/mg为宜，中性蛋白酶1的用量以2.0U/mg为宜，中性蛋白酶2的用量以1.5U/mg为宜，酸性蛋白酶的用量以1.0U/mg为宜，碱性蛋白酶的用量以2.5U/mg为宜。

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